生物化学课件复制

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,十章,基因信息的传递,遗传信息传递的中心法则,DNA,复制,RNA,转录,蛋白质,翻译,RNA,逆转录,复制,蛋白质,翻译,*,DNA,通过基因表达，决定了蛋白质的结构、功能,*,DNA,通过复制，将基因信息代代相传,*,RNA,参与,DNA,遗传信息的表达,*,RNA,也可作为某些病毒遗传信息的载体,本,章,主 要 内 容,1,、复制（,replication,）,2,、基因表达,转录（,transcription,）,翻译（,translation,）,（,gene expression),第,一节,DNA,的生物合成,本,节主要内容,：,1,、,DNA,复制的特征,2,、,参与,DNA复制的物质,3,、,DNA,生物合成过程,5,、逆转录和其他复制方式,4,、,DNA,损伤与修复,一、,DNA,的,复制,(replication),由亲代,DNA,合成两个相同的子代,DNA,的过程。,复制,亲代,DNA,子代,DNA,（一）,DNA,复制的,特征,半保留复制,（,semi-conservative replication,）,半不连续复制,（,semi-discontinuous replication,）,双向复制,（,bidirectional replication,）,有特定的起点,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,一、半保留复制,（一）半保留复制的定义,复制时，母链的双链,DNA,解开成两股单链，各自作为模板指导子代合成新的互补链。子代细胞的,DNA,双链，其中一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。由于碱基互补，两个子细胞的,DNA,双链，都和亲代母链,DNA,碱基序列一致。这种复制方式称为,半保留复制,。,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,C,C,A,C,T,G,G,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,T,C,C,A,T,G,A,C,T,C,C,A,T,G,A,C,A,G,G,T,A,C,T,G,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,+,母链,DNA,复制过程中形成的复制叉,子代,DNA,（二）半保留复制的实验依据,（三）半保留复制的意义,使亲代,DNA,所含的信息以极高的准确度传递给子代,DNA,分子。,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链,(leading strand),随从链,(lagging strand),二,、复制的半不连续性,DNA,双螺旋的两条链是反平行的，而,DNA,合成的方向只能是,53,。,在,DNA,复制时，,1,条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续复制，叫作,前导链,（,leading strand,）；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段（,冈崎片段）,合成，称之为,滞后链,（,lagging strand,）。,领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的,半不连续复制,。,三,、双向复制,双向复制的定义,复制时，,DNA,从,起始点（,origin,）,向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为,双向复制,。,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,真核生物的双向复制,四、,有特定的起始点,原核生物只有一个复制起始点,真核生物有多个复制起始点,（二）,参与,DNA,复制的,物质,1,底物：四种,dNTP,：,dATP,、,dTTP,、,dGTP,、,dCTP,2,聚合酶：依赖,DNA,的,DNA,聚合酶，,DNA-,pol,；,3,模板：指解开成单链的,DNA,母链；,4,引物：提供,3,OH,末端，使,dNP,可以依,次聚合；,5,其他酶和蛋白质因子。,参与复制的主要酶类,（一）,DNA,聚合酶,（二）解链解旋酶,（三）引物酶,（四）,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,全称：依赖,DNA,的,DNA,聚合酶（,DDDP,）,缩写：,DNA,pol,活性：,1.,5,3,的聚合活性,2.,核酸外切酶,活性,复制的化学反应,在聚合酶的作用下，一个核苷酸,5,-P,和相邻的核苷酸上核糖的,3 -OH,生成磷酸二酯键而逐一聚合的形成多核苷酸链。,（,dNMP,）,n,dNTP,（,dNMP,）,n+l,ppi,5 A G C T T C A G G A T,A,3,| | | | | | | | | | |,3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5,3, ,5,外切酶活性,5, ,3,外切酶活性,?,能切除,RNA,引物和突变的,DNA,片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,1,原核生物的,DNA,聚合酶,DNA-pol I,DNA-pol II,DNA-pol ,（,1,）,DNA,聚合酶,：,结构特点,单一多肽链，从,N,端到,C,端有,3,个酶促活性结构域依次排列：,53,外切酶、,35,外切酶和,DNA,聚合酶。,DNA Pol I,在蛋白酶的作用下，可分为大、小两个片段。小片段具有,5,3,外切酶活性。大片段（又称为,Klenow,片段）具有聚合酶活性及,35 ,外切酶活性，它对核酸技术十分有用。,323,个氨基酸,小片段,5, ,核酸外切酶活性,大片段,/Klenow,片段,604,个氨基酸,DNA,聚合酶活性,5,核酸外切酶活性,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,Klenow,片段是实验室合成,DNA,，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol I,在活细胞内的功能,1,）,53,聚合酶的活性：对复制和修复中出现的空隙进行填补。,2,）,35,外切酶活性：对复制中错误进行即时校读，保证复制的准确性。,3,）,53,外切酶活性：可去除,RNA,引物和突变碱基。,（,2,）,DNA-pol II,53,聚合酶活性,35,外切酶活性,无,53,外切酶活性,它只是在无,pol I,及,pol ,的情况下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在,损伤修复中有特殊作用。,（,3,）,DNA pol-,结构特点,由,10,种亚基组成不对称异源二聚体。,核心酶（,）,亚基：,53 ,聚合酶活性,亚基：,3 ,5,外切酶活性和碱基选择功能,亚基,:,可能起组装作用,亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动,复合物：促进全酶组装至模板及增强核心,酶活性,DNA-pol ,(250kD),DNA-pol,在活细胞内的功能,53,聚合酶的活性：,是在复制延长中真正催化新链核苷酸聚合的酶。,35,外切酶活性：,对复制中错误进行即时校读，保证复制的准确性。,催化,DNA,聚合,参与,DNA,损伤的应急状态修复,修复合成、切除引物、填补空隙,功能,20,40,400,分子数,/,细胞,10,1,1,亚基数,+,5, ,外切酶活性,+,+,+,5,外切酶活性,+,+,+,5, ,聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,E. Coli,中的,DNA,聚合酶,2,真核生物的,DNA,聚合酶,DNA,pol ,，,，,，,，,。,DNA,po1,：延长领头链和随从链；,DNApoI,：合成,RNA,引物；,DNA,pol,：校读、修复和填补缺口。,DNApol,：在没有其他,DNA,pol,时,发挥催化功能。,DNApo1,：催化线粒体,DNA,的合成,真核生物的,DNA,聚合酶,（二）与复制起始及解链解旋相关的酶类,在复制起始时需要多种酶和蛋白因子，共同起解开、理顺,DNA,链，维持,DNA,在一段时间内处于单链状态的作用。,1.,与复制起始及解链相关的酶类及蛋白,（,1,）,DnaA,蛋白,（,2,）,DnaB,蛋白（解螺旋酶）,（,3,）,DnaC,蛋白,（,1,）,DnaA,蛋白,DnaA,蛋白是由相同亚基组成的四聚体。,复制起始时，,DnaA,蛋白辨认并结合,E.coli,上,复制起始点,oriC,，,1020,个,DnaA,蛋白相互靠近形成,DNA,蛋白质复合体结构，促使,oriC,局部解链。,E. Coli,基因图,复制起始点（,E,.coli-oriC,）,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATTACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,识别区,AT,富含区,（,2,）,DnaB,蛋白,解螺旋酶,、,复制蛋白,rep,，,利用,ATP,供能，作用于氢键，使,DNA,双链解开成为两条单链。,Dna B,Dna C,解链方向,（,3,）,DnaC,蛋白,Dna C,蛋白的作用是将具有解链酶活性的,Dna B,蛋白运送到复制模板，并协同,Dna B,蛋白的作用。,解链过程中，,DNA,分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,2,DNA,拓扑异构酶（,DNA topoisomerase,）,DNA,拓扑异构酶，改变,DNA,分子构象，理顺,DNA,链，使复制能顺利进行。,分类：拓扑酶,和拓扑酶,作用特点：对,DNA,分子的作用是既能水解，又能连接磷酸二酯键。,DNA,分子一边解链，一边复制，拓扑酶是在复制全过程中都是有作用的。,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,拓扑异构酶,切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。,作用机制,拓扑异构酶作用机制：,3,单链,DNA,结合蛋白,单链,DNA,结合蛋白（,single stranded DNA binding protein,，,SSB,）,的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,模板的,DNA,总要处于单链状态，而,DNA,分子只要符合碱,基,配对，又总会有形成双链的倾向，以使分子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的核酸酶降解。,（三）引物酶,DNA,聚合酶不能从头合成,DNA,链，只能延长已有的,DNA,或,RNA,引物链。,引物酶,（,primase,）在复制起始时催化,引物,（,primer,）,合成，,提供,3,-,OH,末端，使,DNA-pol,能够催化,dNTP,聚合。,引物酶属,DNA,指导的,RNA,聚合酶，但不同于催化转录过程的,RNA,聚合酶。在,E.coli,，引物酶是,dnaG,基因的产物,DnaG,。,（四）,DNA,连接酶 （,DNA ligase,）,连接,DNA,链,3-OH,末端和相邻,DNA,链的,5 ,P,末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的,DNA,链连成完整的链。,特点：连接酶连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的,DNA,单链或,RNA,单链的作用。,功能：在复制中起最后接合缺口的作用，在,DNA,修复、重组、剪接中也起缝合缺口作用，也是,基因工程的重要工具酶之一,。,HO,5,3,3,5,DNA,连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,三种酶催化生成磷酸二酯键的比较,三,、原核生物,DNA,生物合成,（一）复制的起始,（二）复制的延长,（三）复制的终止,1,、,DNA,解链,2,、引发体的形成并合成引物,3,、超螺旋的转型,（一）复制的起始,DnaA,蛋白辨认起始点,形成起始复合物,DnaB,蛋白解螺旋,DnaC,蛋白协助,DnaB,在多种蛋白质参与下，,DNA,解开成单链,SSB,维持单链稳定,Dna A,Dna B,、,Dna C,DNA,拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,引发体的形成,含有解螺旋酶、,DnaC,蛋白、引物酶和,DNA,复制起始区域的复合结构称为,引发体,。,引物的合成,Dna A,Dna B,、,Dna C,DNA,拓扑异构酶,引物酶,OH,SSB,3,5,3,5,引物酶,OH,（三）超螺旋的转型,解链将导致下游发生打结现象或,DNA,超螺旋的其他部分过度拧转。,拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现,DNA,超螺旋的转型,。,复制起始的过程,1,DnaA,蛋白辨认结合,oriC,的重复序列，并与,DNA,形成复合物，引起解链；,2,DnaB,在,DnaC,的辅助下结合于初步打开的双链，并用其解螺旋酶活性开链；,3,拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现,DNA,超螺旋的转型；,4,SSB,结合在已开链的,DNA,模板上，使,DNA,在一定的范围内保持开链状态。,5,引物酶介入，形成的引发体，可按照模板的配对序列，催化,NTP,的聚合，生成引物。,（二）复制的延长,脱氧单核苷酸逐个加入而延长,DNA,新链，其化学反应本质是生成磷酸二酯键。,催化此反应的酶：,原核生物：,DNA-pol ,真核生物：,DNA-pol,催化不连续复制,DNA-pol,催化连续复制,（）复制延长的生化过程,复制起始时，母链即已解开，两股单链都是模板，其作用是按碱基配对规律指引核苷酸加入到新链,。,每次加入的单个核苷酸，都是以,dNTP,为原料，复制时子链从,5,向,3,延长。,复制延长速度相当快。,E.coli,每秒钟能加入的核苷酸数达,2500,个。,（二）复制的半不连续性和冈崎片段,在形成双螺旋结构时，,DNA,双链的走向是相反的。,复制经解链后，两股单链在复制叉上也是走向相反。,复制，包括引物合成，只能从,5,向,3,延伸。而在同一复制叉上，解链的方向只可能有一个。,复制方向与解链方向不一致 可以理解不连续复制的成因,1,领头链连续复制,顺着解链方向而生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链（,leading strand),。,2,随从链不连续复制,复制的方向与解链方向相反生成的子链称为,随从链,（,lagging strand,）,。,随从链,的复制必须等待模板链解开至足够长度，才能从,53,方向生成引物然后复制。,随从链,在延长时，又要等到下一段暴露出足够长而度的模板，,再次,生成引物而延长。这就是不连续复制。,随从链的合成,随从链,3,冈崎片段,随从链不连续复制的片段称为冈崎片段，其大小在,1000,2000,个核苷酸。,每一个不连续复制的片段,5-,端都带有一个,RNA,引物。,片段的复制完成后，,RNA,引物会被除去而代之以,DNA,片段，因此复制至最后，两股子链都是,DNA,链。,冈崎片段,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,冈崎片段,在同一个复制叉上，领头链的复制先于后随链，但两链是在,同一,DNApol,催化下进行。即随从链的模板可折叠或环绕成环状，与前导链正在延长的区域对齐，使领头链和随从链的生长点都处在,DNApol,催化位点上。,解链方向就是酶的前进方向，也是复制叉延伸方向。,复制延长简图,（三）复制的终止,原核生物基因是环状,DNA,，双向复制的复制片段在复制的终止点,(ter),处汇合。,复制的起始点和终止点刚好把环状,DNA,分为两个半圆，两个方向各进行,180,，同时在终止点汇合。,为了定位方便，习惯把,E.coli,的,DNA,分为,100,等分。,E.coli,复制起始点,oriC,在,82,位点，复制终点,ter,（,termination,）在,32,位点。,E,coli,基因图,ori,ter,E.coli,82,32,ter,oriC,5,5,DNA-pol ,5,OH,P,5,DNA-pol ,dNTP,5,5,P,5,5,ATP,ADP+Pi,DNA,连接酶,随从链上不连续性片段的连接,逆转录和其他复制方式,Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,逆转录酶,(reverse transcriptase),逆转录,RNA,DNA,逆转录酶,一、逆转录病毒和逆转录酶,（一）逆转录,在逆转录酶的作用下以,RNA,为模板合成,DNA,的过程。此过程中，核酸合成与转录（,DNARNA,）过程遗传信息的流动方向相反（,RNADNA,），故称为,逆转录（,reverse transcription),。,（二）逆转录病毒,RNA,病毒的基因组是,RNA,而不是,DNA,，其复制方式是逆转录，故称为,逆转录病毒（,retrovirus,）。,RNA,病毒感染活细胞后，要先经逆转录成为双链,DNA,，通过基因重组方式，参加入宿主细胞基因组，并随宿主细胞复制和表达。这种重组方式称为整合（,integration,）。,病毒基因的整合可能是病毒致癌的重要方式。,（三）逆转录酶,能催化以单链,RNA,为模板合成双链,DNA,的反应的酶称为,逆转录酶（,reverse transcriptase),。,它兼有三种酶的活性：,RNA,指导的,DNA,聚合酶，,DNA,指导的,DNA,聚合酶和,RNase H,活性。,所谓,RNase H,活性是指除去杂合分子中的,RNA,。它可以从,53,和,35,两个方向水解,DNA,RNA,。,逆转录酶和其他,DNA,聚合酶一样，合成,DNA,的方向为,53,，并且不能从头合成,DNA,，也需要引物，是病毒本身的一种,tRNA,。,二、逆转录过程,1,以单链,RNA,的基因组为模板，在逆转录酶,(RNA,指导的,DNA,聚合酶,),的催化下，合成一条单链,DNA,；,2,产物与模板生成,RNADNA,杂化双链，杂化双链中的,RNA,被逆转录酶,(RNase H),水解；,3,以新合成的单链,DNA,为模板，,逆转录酶,(DNA,指导的,DNA,聚合酶,),催化合成第二链的,DNA,。,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,RNA,模板,逆转录酶,DNA-RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,逆转录酶,A AA A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,三、逆转录酶和逆转录现象的生物学意义,（一）逆转录酶和逆转录现象是分子生物学研究中的重大发现,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,（二）对逆转录病毒的研究，拓宽了病毒致癌理论。,（三）分子生物学研究应用逆转录酶（,cDNA,法,),，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一。,第五节,DNA,损伤（突变）与修复,DNA Damage (Mutation) and Repair,一、突变的定义,二、突变的意义,三、引发突变的因素,四、突变的分子改变类型,五、,DNA,损伤的修复,一、突变的定义：,个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段,DNA,在构成、复制或表型功能上的异常变化，称为突变（,Mutation,），,也称为,DNA,损伤（,DNA damage,）。,遗传物质结构改变引起遗传信息的改变。,二、突变的意义,（,）突变是进化、分化的分子基础,自发突变或自然突变,（二）突变导致基因型改变,多态性：个体之间的基因型差别。,（三）突变导致死亡,突变发生在对生命过程至关重要的基因上，可导致个体、细胞的死亡。,（四）突变是某些疾病的发病基础,有害的突变,三、引发突变的因素,（一）自发突变,（二）诱发突变,1,物理因素：,主要指紫外线和各种辐射，如紫外线可引起,DNA,链上相邻,的两个,嘧啶碱基,发生共价结合，生成嘧啶二聚体。,2,化学因素：,化工原料、化工产品和副产品，各种工业的排放物、农药、食品防腐剂或添加剂，以至汽车排放的废气。,嘧啶二聚体的形成与解聚,四、突变分子改变的类型,错配,(mismatch),缺失,(deletion),插入,(insertion),重排,(rearrangement),框移,(frame-shift),（一）错配（,mismatch,）,DNA,分子上的碱基错配称,点突变,(point mutation),。,点突变发生在基因的编码区域，可导致氨基酸的改变。,1.,转换：,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,2.,颠换：,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,镰形红细胞贫血病人,Hb (HbS) ,亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,val,glu,C,肽链,C,A,C G,T,G,基因,正常成人,Hb (HbA),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,glu,glu,C,肽链,C,T,C G,A,G,基因,膀胱癌细胞,c-rasH,基因点突变,（二）缺失、插入和框移突变,缺失：,一个碱基或一段核苷酸链从,DNA,大分子上消失。,插入：,原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到,DNA,大分子中间。,框移突变：三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同,。,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C ,缺失,C,缺失引起框移突变,（三）重排（,rearrangement,）,DNA,分子内发生较大片段的交换，称为重组或重排。,移位的,DNA,可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,四、,DNA,损伤的修复（,DNA repairing,）,修复是指针对已发生了的缺陷而施行的补救机制。,修复的主要类型：,（一）光修复,(light repairing),（二）切除修复,(excision repairing),（三）重组修复,(recombination repairing),（四）,SOS,修复,（一）光修复,光修复过程是通过光修复酶（,photolyase,）催化而完成的，仅需,300,600nm,波长照射即可活化，普遍存在于各种生物，人体细胞中也有发现。,通过此酶作用，可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态，,DNA,完全恢复正常。,光修复,光修复酶,(photolyase),UV,（二）切除修复（,excision repairing,）,细胞内最重要的修复机制，包括去除损伤,DNA,，填补空隙和连接。,1,、原核生物,DNA,损伤修复：,UvrA,，,UvrB,辨认及结合,DNA,损伤部位；,UvrC,在解螺旋酶的协助下切除损伤部位。,DNA-pol,和连接酶,填补空隙和连接。,2,、真核生物,DNA,损伤修复：,XP,类蛋白辨认和切除损伤,DNA,部位，切除后留下的空隙，则由,DNA-pol,及,加以修复。,E.coli,的,切除修复方式,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA,聚合酶,OH,P,DNA,连接酶,ATP,（三）重组修复（,recombination repairing,）,当,DNA,分子的损伤面较大，还来不及修复完善就进行复制时，损伤部位因无模板指引，复制出来的新子链会出现缺口，这时，就靠重组蛋白,RecA,的核酸酶活性将另一股健康的母链与缺口部分进行交换，以填补缺口。,损伤链移到己完成复制的链上，如果损伤又只发生在双链,DNA,中的一股单链，则下一轮的复制损伤链就只占,DNA,的,1,4,，不断复制后，其比例就越来越低，称为把损伤链“稀释”掉。,重组修复,（四）,SOS,修复,是一类应急性的修复方式。由于,DNA,损伤广泛至难以继续复制，由此而诱发出一系列复杂的反应。,在,E. coli,，各种与修复有关的基因，组成一个称为,调节子,(regulon),的网络式调控系统。,特点：反应特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过,SOS,修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而，,DNA,保留的错误会较多，引起较广泛、长期的突变。,