鱼骨胶原蛋白改

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,罗非,鱼鱼骨胶原蛋白分离纯化实验方案,一,、理化性质,二,、实验器材,三,、提取分离,四,、,SDS-PAGE,目 录：,物理性质,：,（,1,）等电点：,在某一,pH,溶液中表现出不带电荷，呈两性离子状态，即所带正电荷和负电荷相等（零电荷），这一,pH,称为蛋白质的等电点。,（,2,）溶解性：,胶原蛋白往往出现两个等电点，一个在,pH 4.5 5.0,；另一个在,pH 6.8 8.0,，所以胶原蛋白会出现两个最低溶解度。,胶原蛋白理化性质,化学性质：,（,1,）两性电解质：,pHpI,时，蛋白质带负电，向阳极移动；,ph=pI,时，蛋白质不带电，不移动。,（,2,）酸碱膨胀：,胶原肽链间的氢键和离子键乃至共价键在酸或碱的作用下有所破坏，使胶原结构松散。,（,3,）盐的作用：,胶原在盐溶液中会发生其肽链间的离子键被盐解离的阴、阳离子打开，从而吸水膨胀。,（,4,）显色反应：,茚三酮反应、双缩脲反应、酚试剂反应,罗非鱼鱼骨胶原蛋白介绍,罗非鱼骨基本成分,鱼排蛋白质中有,80%,的胶原蛋白，主要为,I,型胶原蛋白，,II,型胶原蛋白可以从软骨中提取得到。其中,I,型至少有两种,肽链（,1,和,2,）组成，它们的分子大小、亚基构成很相近，含有大量,肽链，,1,含量接近,含量，,1,分子量约为,130 kDa,，,2,分子量约为,118 kDa,，,分子量约为,200 kDa,。,成分,蛋白质,脂肪,水分,碳水化合物,灰分,胶原,含量（,%,）,37.17,3.51,20.10,微量,39.24,30.97,二,、分离纯化,材料、药品及仪器,实验方案,材料、药品及仪器：,新鲜罗非鱼（市售）、乙酸、柠檬酸、氯化钠、,EDTA,、乙醚、,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、蛋白质标准品、猪胰蛋白酶等,(,均为分析纯,),电,子天平,、粉,碎机,、冷冻干燥机、电,热恒温水浴锅、,UV,分,光光度计,、高速冷冻离,心机,、聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳装置等。,实,验,流,程：,鱼排清除残余鱼肉,清水清洗晾干,脱脂,去除盐,去除杂蛋白,所有过程在,10,下进行，防止变性,提取,精制,胶原,1,、鱼骨脱脂工艺,取,50g,粉碎的鱼骨加入物料比为,1:20,的乙醚在,4,下浸泡,1d,。,2,、鱼骨脱盐去杂工艺,取,50g,左右脱脂后的鱼骨粉，加入其质量,5,倍的,0.5mol/L EDTA,溶液（,pH 7.4,）于,4,下浸泡,5 d,，每天更换一次,EDTA,溶液，用蒸馏水反复洗涤，再以其质量,20,倍的,0.1mol/L,NaOH,溶液,4,下浸泡,12,小时，再用蒸馏水冲洗至中性。,除去非胶原蛋白及防止内源性蛋白酶对胶原蛋白的影响,脱钙作用,3,、胶原的提取,鱼骨经脱盐去杂后，加入等量的,0.5mol/L,乙酸溶液并在,4,下浸泡,3d,，提取液中含有,1%,的胃蛋白酶，,5000r/min,离心,20,分钟去除杂质，收集上清液，即得到胶原粗提液。提取过程不断搅拌。,酸溶性胶原,切去末端肽，使三螺旋结构的主体部分溶解在稀酸中,4,、胶原的精制工艺,粗提液缓慢加入氯化钠粉末，使其终浓度达到,0.9 mol/L,，盐析过夜，,5000r/min,离,心,20,分钟，弃去上清液，沉淀用,10,倍体积,0.5mol/L,的乙酸溶液溶解，,5000r/min,离心,20,分钟去除杂质，上清液再次重复盐析、离心，溶解操作，最后用蒸馏水透析,3,天，每天更换透析液，冻干即得胶原精制品。,四,、检测方法,SDS-PAGE,电泳,原理：利用,SDS,这种阴离子去垢剂，,SDS,带有大量的阴离子，,SDS,和蛋白质分子结合后形成长柱形的复合物，,SDS,在外侧，蛋白质分子在内测，从而使得和蛋白质分子的电泳速度唯一有关系的是蛋白质分子量。,蛋白质浓,度：,Folin-,酚试剂法,原理,：,Folin,试剂中的磷钼酸,-,磷钨酸盐被蛋白质中的色氨酸 和酪氨酸残基还原，发生显色反应：产生蓝色（钨兰,+,钼兰）。蓝色的浓重度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。,Thank you!,