实验一蛋白质的定量测定

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,实验一 蛋白质的定量测定,Folin-酚试剂法(Lowry法),蛋白质及氨基酸的呈色反应,（一）双缩脲反应,是由两分子尿素缩合成一种化合物的反应。,2尿素,双缩脲+氨,180度,双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的,紫红色络合物,，这一呈色反应称为双缩脲反应。,蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成,紫红色或蓝紫色络合物,。通常可用此法来定性鉴定蛋白质的存在，也可根据反应生成颜色的深浅，在540nm波长处进行比色，定量测定蛋白质的浓度。,允许测定范围为蛋白质/ml。,（二）蛋白质的黄色反应,芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。,蛋白质遇硝酸后，产生白色沉淀，加热后沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深呈橙黄色。,（三）酚试剂反应,蛋白质分子一般都有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。,（四）乙醛酸反应,在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基结构的化合物都有这一反应。,（五）坂口反应,精氨酸分子中所含量胍基能与次溴酸钠（或次氯酸钠）及,-萘酚在碱性溶液中形成红色产物。,（六）米伦反应（illon）,米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸的混合液。蛋白质溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变为红色。酚类化合物有此反应。,常用的蛋白质定量测定的方法,凯氏定氮法,双缩脲法,Folin-酚法,紫外（UV）分光光度法,考马斯亮兰染色法,一、实验目的,1.学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理。,2.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。,二、实验原理,Folin酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。,进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：,若蛋白质含量高时（25-100g）在500nm波长处进行测定，含量低时(5-25g)在755nm波长处进行测定。,最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。,此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。,缺点是此反应受多种因素干扰。,在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。,此法是在Folin酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠氢氧化钠浓度12倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。,三、实验材料,（一）实验器材,100毫升容量瓶 2只；移液管 1毫升4支，5毫升2支；722型分光光度计。,（二）实验试剂,试剂甲：,1) 4%碳酸钠溶液,2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液,3) 1%硫酸铜溶液,4) 2%酒石酸钾钠溶液。,临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。,试剂乙：,称钨酸钠（Na2WO22H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO42H2O）25g置2000ml磨口回流装置内，加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为,鲜黄色,，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。,试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红紫红紫灰墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。,（二）标准和待测蛋白质溶液,1. 标准蛋白质溶液,结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150ug/ml蛋白溶液,2. 待测蛋白质溶液,人血清，使用前稀释100倍。,四、实验操作,1. 绘制标准曲线:取7支试管，按下表分别加入各试剂,试,剂,管 号,0,1,2,3,4,5,6,标准蛋白质溶液(ml),0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,蒸馏水(ml),1.0,0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,Fo1in-酚试剂甲(ml),5,5,5,5,5,5,5,摇匀，室温下放置10分钟,Fo1in-酚试剂乙(ml),0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,迅速摇匀，30（或室温2025）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在500nm处比色,A500,各管加入Fo1in-酚试剂乙后，立即摇匀，放置30分钟后比色，在,500nm,处记下各管光密度，以0号管为对照，以光密度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。,2. 测定未知样品：,取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加5毫升Fo1in-酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in-酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值。,2.未知样品蛋白质浓度测定,取4支试管，分2组，按下表平行操作：,试管编号,试剂处理,空白管,2,样品管,2,血清稀释液/ml,0,0.2,蒸馏水/ml,1.0,0.8,Folin酚甲试剂/ml,5.0,5.0,摇匀，于2025放置10min,Folin酚乙试剂/ml,0.5,0.5,迅速摇匀，30（或室温2025）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色,A,500,五、注意事项,(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性的铜蛋白质溶液。当Folin酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前。,(2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。,【思考题】,1.Folin-酚法进行蛋白定量测定的优缺点。,2.常用的蛋白质含量测定方法在哪些？,