植物组织培养学

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,器官发生与体细胞胚胎发生,一器官发生,（一）概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程。,（二）发生方式：有两种发生方式,（1）直接发生：（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）,（2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。,二）胚状体方式(somatic embryo)指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。,由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：,1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。,2)胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。,3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。,由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：,1),外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。,2),胚状体形成,在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。在组织培养条件下胚状体的发育过程类似于合子胚的发育：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。,3),胚状体再发育成完整植株,在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。,胚状体与不定芽的区别,胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：,最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。,胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。,胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。,胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状体产生伪数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的。,胚状体与合子胚的比较,合子胚,胚状体,质量,萌发率高，质量好,萌发率低，质量差,来源,受精卵,体细胞,胚柄,有，明显,即使有也不明显,形态,固定，体积相对较小,复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大,变异率,低,高,（三）影响体细胞胚胎发生的因素,1,生长调节物质,（,1,）生长素类：,我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进行分析（教程,P99,），在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养（增殖培养基），通常所用的生长素是,2,，,4-D,，浓度范围,0.5,1mg/L,。在这样一种培养上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。然而，如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基）上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。边疆保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的：诱导培养基：，而把每个胚性细胞团看成是一个无结构的胚。,（,2,）细胞分裂素类：,细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反的结论，既或促进也可抑制体细胞胚的发生，这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用，特别有利于子叶的发育。另外有研究表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发现，虽然,BAP,和激动素对胚胎发生过程表现抑制作用，但浓度为,0.1mol/L,的玉米素却能促进这个过程，而,BA,对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。,（,3,）赤霉素类：,赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生，但对于许多植物而言，赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌发有促进作用。,（,4,）脱落酸：,抑制剂特别是,ABA,，在体细胞胚胎发生过程中的作用正逐渐被提示出来，,ABA,是一种天然产生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量（通常是,0.11M,）的,ABA,用于荷兰芹属培养物时，可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌发。,2,氮源,氮源的形态有还原态氮（,NH,4,+,）和氧化态氮（,NO,3,）两种。在以,KNO,3,为唯一氮源（如,White,培养基）的培养上建立起来的愈伤组织，去掉生长素以后不能形成胚。然而是，若在培养基中加入少量,NH,4,Cl,即可明显促进胚状体的发育，上述结论是否说明，胚胎发生过程中还原态氮是必需的？我们可以对以下的实验进行分析。,Reinert,及基合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中,(,培养基均为,White,培养基,),得到以下结果：,NH,4,+,氮,（M,）,NO,3,氮,（,M,）,体,胚发生数（个,/2ml,）,10 40 1131219,0 55 190.3,0 95 11.34.1,从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。,三长期培养物形态发生潜力的丧失,有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官发生或胚胎发生的潜力，但经过反复继代保存之后喧种形态发生能力常常逐渐下降，有些甚至完全损失。为了解释这种现象，现在有三种假说。,1,遗传说,该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，可以推知，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。,2,生理说,从前面体细胞胚胎发生中的甜橙的驯化组织的形成的实例中，不难分析，随着不断的培养继代的进行，培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变，而导致不能形态发生。在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部处理条件，应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复。,3,竞争说,这个假说本质上是前两个假说的结合。按照这个假说的倡议者,Smith,和,Street,（,1974,）的看法，在胡萝卜细胞长其连续继代培养基间，有两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终的丧失有关。首先，细胞对于生长素（,2,，,4-D,）抑制全能性表达的作用变得比较敏感；基次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位，实际上，,Jones,（,1974,）已经证实，在胡萝卜培养物中，细胞群体在成胚能力上的不稳定性，可能是由用于建立该培养物的组织带来的。在复杂的多细胞外植体中，只有少数细胞能够产生胚性细胞团，其余细胞都是无法表达其全能性的。按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会爱步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。,快速繁殖与脱毒培养,第一节,快速繁殖（微繁殖）,概念：所谓快速繁殖，就是得用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织在人工控制的适宜条件下，迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。,特点：繁殖速度快；使用材料少，生产效率高，省时省工；节约空间有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。,主要适用于（,1,）加速某些难繁或繁殖速度低的植物，特别是一些珍稀名贵的花卉，需要发展的濒危植物的繁殖。（,2,）用有性繁殖的方法难以保持品种特性的异花授粉植物，如油棕、猕猴桃、非洲菊等。（,3,）需要去除病毒的植物。（,4,）原种很少，生产上又急需推广的植物。,快速繁殖过程,快速繁殖过程一般包括四个阶段，即无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根和试管苗的移植。,1,外植体的选择,选择适当的外植体对于快速繁殖能否成功是极其重要的，而选择什么样的外植体首先决定于第二阶段芽的增殖所采用的途径。,通过腋芽的形成来增加芽的数量时,，应从带有营养芽的部分得到外植体，并注意以下问题。（,1,）外植体大小，如为一般繁殖而非脱毒繁殖，可使用普通茎尖、芽或带芽的茎切段作为外植体。（,2,）取材植株的生理状态对培养成败是极重要的，一般在植物开始生长，芽已膨大但芽鳞片还未张开时最为合适，此时芽生长旺盛，并有芽鳞片的保护，不易污染。为了避免季节的影响，在有条件时也可以将植物放在光、温条件稳定的人工气候箱或温室中，使植物保持营养生长状态，对某些需低温或高温或特殊光周期处理才能打破休眠的块茎、鳞茎、球茎等，常要处理后才可剥取茎尖进行培养。（,3,）芽在植物株上的部位也是需要注意的，在一些草本植物（如菊花等）中，使用顶芽或上部的芽作为分生组织或茎尖培养时的成功率常比侧芽或基部的芽要高，这可能和它们生长较旺盛有产。（,4,）多年生的木本植物随着年龄的增加，分生组织、茎尖和芽的培养越困难，特别是成年树较幼态树的培养要困难得多，此时，常使用部分返幼阶段或年龄较低的根蘖苗或不定芽做材料，或采取某些措施如将芽接在实生苗上，修剪、保持高水平的水肥进行营养繁殖，或用细胞分裂素喷洒植株的方法等。,在通过不定芽途径使芽增殖时,，可以根据不同的植物采用不同的外植体，如根、茎、叶或花器官的各部分，在自然界中能够产生不定芽的器官应当首先被采用，如非洲紫罗兰、秋海棠、大岩桐、落地生根等可用叶片，某些兰花等可以用茎尖；很多种植物，特别是单子叶植物，可以作用花器官，如黄花菜、鸢尾等。,在使用体细胞胚胎发生途径时,，常使用胚分生组织或生殖器官作为外植体,2,外植体的消毒,（三）芽的诱导及扩大化繁殖（增殖）,这是快繁技术中最重要性一环，在这一阶段潜在的植物体体（芽或胚状体）通过腋芽的形成和生长、外植体或愈伤组织上不定芽的形成和胚状体发生三条件途径在数量上得迅速增殖，由于外植体种类的不同，在增殖时可能采用的途径不同。,1,促进腋芽的形成和生长,在高等植物的每一个叶腋中通常都存在着腋芽，每一个腋芽在一定的条件下都能生长并形成一个枝条，项端优势可抑制腋芽生长，使用外源的细胞分裂素可以打破顶端优势，促进腋芽生长。在培养条件下，为了促使腋芽生长，需在培养基中加入一定浓度的合适种类的细胞分裂素，有时同时可加入少量的生长素以促进腋芽的生长（注意：生长素过多易导致愈伤化）。由于细胞分裂素的持续作用，腋芽生长成枝条，新产生的枝条的腋芽在细胞分裂素的作用下又可生长，这样反复数次就可以形成一丛嫩枝，将它们切割成带有几个芽的小块接种到同样的培养基上，这一过程又能重复进行，这样就可以在短时间内产生大量的芽。有些植物即使在含有细胞分裂素的培养基中其项端优势也不易被打破，接种的茎尖只能长成不分枝的一根枝条，此时可以用切段法（每个切段带