重组DNA技术

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,第四篇 遗传与变异,23,重组,DNA,技术,基因重组：,自然界,随机发生；人为操作,有目的,往往引入外源基因。,23,重组,DNA,技术,23,重组,DNA,技术,重组,DNA,技术，也称,基因工程或遗传工程。,基因工程是指将特定的基因（即外源基因），通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中,与受体细胞的基因进行重组，并能增,殖、表达，这样一种遗传学操作。,基因工程的主要目的,:,通过与优良性状相关的基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种或新产品。,基因工程的优点,A.,克服物种间的屏障；,B.,有目的、有计划、有选择地加工制造各种生物制品；,C.,遗传育种、医学等研究和开发。,23,重组,DNA,技术,23,重组,DNA,技术,重组,DNA,技术,23,重组,DNA,技术,基因工程,23,重组,DNA,技术,23.1,基因工程的相关技术,23.1.1,核酸的分子杂交,1.DNA,的变性与复性,DNA,变性,较高温度,DNA,解链成单链。,DNA,复性,变性的,DNA,逐渐冷却，分离的两条单链,通过,碱基互补配对重新恢复成双链的,DNA,分子。,短链容易精确复性；长链复性较难。,杂交分子,不同来源的单链,DNA,，只要碱基序列大部分互补，就可以复性。,DNA,与,RNA,之间，也一样可以,通过,碱基互补配对形成杂交双链分子。,23,重组,DNA,技术,2.,分子探针寻找特定基因,放射性标记的,DNA,或,RNA,分子。,3.Southern,印迹,可以检测特定的,DNA,序列。,23,重组,DNA,技术,Southern,印迹,23,重组,DNA,技术,4.Northern,印迹,可以检测特定基因的表达情况。,5.,原位杂交,可以检测特定细胞中某一基因的表达情况。,23,重组,DNA,技术,23.1.2 PCR,1.PCR,技术的基本原理,PCR,反应过程：,双链,DNA,变性（,90,95,）成为单链,DNA,；,引物复性（,37-60,）同单链,DNA,互补序列结合；,DNA,聚合酶催化（,70,75,）使引物延伸。,23,重组,DNA,技术,PCR,原理,23,重组,DNA,技术,2.,Taq,DNA,聚合酶,耐热,3.,寡核苷酸引物,4.PCR,技术的应用,基因克隆、特定,DNA,序列鉴定（基因鉴定、,DNA,指纹识别）,23,重组,DNA,技术,23.2,基因工程主要的工具酶,23.2.1,限制性内切（核酸）酶,（,1,）限制性内切酶的作用,识别,DNA,中特定核苷酸序列，使每条链的一个磷酸二酯键断开。,（,2,）限制性内切酶的类型,I,型、,II,型和,III,型。,II,型酶基因工程。,（,3,）,限制性内切酶的命名,根据来源命名。如,Eco,R,I,大肠杆菌（,E.coli,）、,R,株系、第一种。,23,重组,DNA,技术,（,4,）限制性内切酶的识别序列,能识别的特定核苷酸序列。,46,个碱基对组成，且碱基互补对称。,只写单链的核苷酸序列。,（,5,）限制性内切酶的切割位点,II,型酶切割位点在识别序列区内。,23,重组,DNA,技术,（,6,）切割片段的末端,A.,粘性末端,两条链末端交错对称。,5,粘性末端,3,粘性末端,B.,平头末端,两条链末端平齐。,23,重组,DNA,技术,粘性末端,23,重组,DNA,技术,23.2.2 DNA,连接酶,催化,-PO,4,和,-OH,形成磷酸二酯键。,（,1,）,E.Coli,DNA,连接酶,大肠杆菌,（,E.Coli,）,基因组编码；,连接具互补粘性末端的,DNA,片段。,（,2,）,T,4,DNA,连接酶,T,4,噬菌体,DNA,编码；,既连接具互补粘性末端的,DNA,片段，也能连接平头末端。,23,重组,DNA,技术,23.2.3,反转录酶,从反转录病毒中制备得到的。,该酶能以具有,3-OH,的,DNA,或,RNA,为引物，以,mRNA,为模板从,53,聚合生成,cDNA,。,23,重组,DNA,技术,23.3,基因,(,克隆,),的质粒载体,基因载体,运送外源,DNA,片段进入受体细胞。,需具备三个条件：,有插入位点；,能在受体细胞内复制；,有筛选标记基因。,23,重组,DNA,技术,质粒,A.,存在于细菌；蓝藻、绿藻、真菌。,B.,染色体外裸露环状双链,DNA,分子，小的不足,1500bp,，,大的,100kb,以上。,C.,宿主细胞内能自主复制。分为松弛型和严紧型复制两种类型质粒。选用分子小和松弛型复制的质粒（即有高的拷贝数）。,23,重组,DNA,技术,质粒载体,pBR322,A.,有复制起始点，能在受体细胞内复制；,B.,有,2,种筛选标记基因；,C.,有允许外源,DNA,插入的位点；,D.,有高的拷贝数。,23,重组,DNA,技术,pBR322,图谱,23,重组,DNA,技术,23.4,重组,DNA,的基本步骤,23.4.1,获得目的基因,1.,构建基因组文库分离目的基因,2.,人工合成,DNA,3.,利用反转录酶构建,cDNA,文库分离目的基因,4.,用,PCR,技术从基因组中扩增特定的基因片段,23,重组,DNA,技术,23.4.2 DNA,分子的体外重组,酶切和连接。,23,重组,DNA,技术,23.4.3,重组,DNA,分子引入宿主细胞和筛选鉴定,1.,重组,DNA,引入宿主细胞,原核生物细胞是,很好的受体细胞容易摄取外界的,DNA,，,增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作。大肠杆菌、蓝藻、农杆菌等。,2.,重组体克隆的筛选与鉴定,抗性筛选；鉴定的证据越充分越好。,23,重组,DNA,技术,转基因植物筛选,23,重组,DNA,技术,阳性克隆的,PCR,鉴定,23,重组,DNA,技术,转,GFP,动物,23,重组,DNA,技术,转,GFP,植物,23,重组,DNA,技术,23.5,基因工程的应用及其成果简介,基因工程,干扰素、人生长素、人胰岛素、乙肝疫苗、红细胞生成素、血纤维蛋白溶酶原激活剂（溶栓药）等。,基因工程农作物新品种也已在一些国家在大田种植，如抗虫棉、抗虫玉米、耐储黄瓜等。,1.,生产新型疫苗,2.,生产人胰岛素,3.,生产人生长素,4.,生产干扰素,23,重组,DNA,技术,5.,动、植物基因工程,转基因动物,（,1,）模式动物,模式动物可用来揭示生物学困难领域中的许多奥妙，像人脑、免疫系统和胚胎发育等。,在试验遗传病的新疗法中，模式动物也很有用。,癌鼠；转基因猴。,模式动物,23,重组,DNA,技术,23,重组,DNA,技术,（,2,）生物反应器动物,生物反应器动物：利用其乳腺分泌药用蛋白质来制药的转基因动物。,羊,-,乳球蛋白启基因动子、,-,抗胰蛋白酶,。,（,3,）供体动物,英国科学家在,1992,年,12,月成功培育出转基因猪，其心脏带有人类的成分；猪心脏来代替人心脏用于移植手术。,23,重组,DNA,技术,转基因植物,抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆、作物的高产优质、果蔬储存、作物的固氮能力、药物生产及环境美化等。,（,1,）抗虫植物,苏云金杆菌、毒蛋白（在昆虫碱性肠道中水解成有毒性的小肽）。,23,重组,DNA,技术,（,2,）抗除草剂植物,草甘磷是一种广谱除草剂。它的靶位点在叶绿体中的,EPSP,合成酶。由于阻断芳香族氨基酸的合成，植物最终会死亡。,细菌中分离到的一个突变株有,EPSP,合成酶突变基因。此基因抗草甘磷，引入此基因后，已得到抗性植物。这样施用草甘磷，可杀死除转基因植物外的所有植物。,psbA,编码（光基因,32,）,D1,蛋白,。该蛋白是,除草剂,Atrazine,等的结合受体,。,若,#264,aa,发生丝氨酸为甘氨酸取代,，,植物成为抗性型,。,利用这一特点，已成功培育出抗阿特拉津的作物。,23,重组,DNA,技术,（,3,）,改良药,用植物,日本科学家用重组,DNA,技术提高了镇静药莨莞碱合成的效率。,莨莞碱合成率取决于,H,6,H,酶。克隆天仙子,H,6,H,酶的,cDNA,，然后用,Ti,质粒把,CaMV35S H,6,H,导入颠茄。,常规颠茄天仙子碱很少能转化成莨莞碱，而导入,H,6,H,酶基因后，它们,100%,转化。收率从,0.3%,提高到,1%,，而且这一特性可传给后代。,（,4,）生产疫苗的植物,土豆生产疫苗。,23,重组,DNA,技术,6.,基因诊断和基因治疗,1990,年，首例应用基因治疗，治愈一名四岁女孩的腺苷脱氨酶缺乏症。采用逆转录病毒转移腺苷脱氨酶基因。,基因治疗基因：单基因疾病基因,导致腺苷脱氨酶缺乏症、镰刀形贫血病等；肿瘤抑制物基因和肿瘤形成基因等。,腺病毒、脂质体和单疱疹病毒等作为载体,囊性纤维化病、帕金森氏病。爱滋病和癌症。,23,重组,DNA,技术,人类胚胎发育早期和,基因诊断,转基因技术在基因表达调控研究中的应用,23,重组,DNA,技术,23,重组,DNA,技术,23.6,遗传工程的风险和伦理学问题,1.,对人的影响,“超级细菌”、对宗教、习俗和生活方式的影响。,用抗菌素抗性基因整合的转基因食品的利用，遭到一部分人的反对。因为人们担心以后会有太多的抗抗菌素生物产生，甚至产生无法对付的超级病菌。,23,重组,DNA,技术,2.,对环境的影响,转基因的逃逸；超级细菌；超级杂草；对生物多样性的影响。,利用抗除草剂基因筛选的办法，也由于人们担心会产生超级杂草，而遇到类似的情况。,3.,严格的释放规定,生物安全实验室规则。,