实验5-琥珀酸脱氢酶 ALT

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,琥珀酸脱氢酶的作用,及其竞争性抑制,生物化学与分子生物学系,陈园园,实 验,7,了解琥珀酸脱氢酶的作用及,酶促反应中的竞争性抑制作用,实 验 目 的,竞争性抑制作用,抑制剂和底物的结构相似，,能和酶的底物分子竞争,与酶的活性中心相结合，,从而阻碍酶与底物结合,形成中间产物。,酶活性位点,抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力,以及抑制剂和底物浓度比。,加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。,实 验 原 理,延胡索酸,琥珀酸,还原型甲烯蓝,(,白,),琥珀酸脱氢酶,甲烯蓝,(,蓝,),E,+ S ES E + P,琥珀酸,丙二酸,E,+,I,EI,琥珀酸脱氢酶,FAD FADH,2,操 作 步 骤,1,、酶提取液的制备,11.3 g,兔肌肉,(,剪碎,),海砂少许,(1/3,匙,),+2m,l,磷酸盐缓冲液,(,1/15 mol/L,),，,研磨成糊状,，,然后再加,10m,l,磷酸盐缓冲液,(,1/15 mol/L,),混匀。,2,、纱布过滤（双层）,3,、取小试管五只，按书上,P40,表格加入各试剂。,最后加石蜡隔绝空气，,37,水浴保温。,每间隔,1015min,观察一次结果，并记录。,实 验 结 果,编号,1,2,3,4,5,酶,有,有,有,有,无,底物,+,+,+,+,+,抑制剂,-,+,+,+,-,结果,注 意 事 项,注意区分肌肉与筋膜；,家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多；,12 ml,缓冲液要分次加入，不可一次性加入；,碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干；,滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度；,滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可；,观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝；,实验完成后试管要用皂粉清洗。,改良,Mohum,法测定鼠肝谷,-,丙转氨酶,(,GPT,),活性,实 验,22,实 验 目 的,掌握,GPT,活性测定的基本原理,熟悉,GPT,活性测定的具体操作方法,了解血清,GPT,活性测定的临床意义,实 验 原 理,GPT,2,4-,二硝基苯,丙氨酸,丙酮酸,-酮戊二酸,谷氨酸,在,520nm,波长测定其光密度，与已知浓度的丙酮酸溶液比较，即可计算谷,-,丙转氨酶的活性,丙酮酸二硝基苯,（碱性溶液中呈棕色）,血清谷,-,丙转氨酶活性单位,在pH 7.4、37条件下，,每毫升肝匀浆与底物保温30min后，,每生成2.5,g的丙酮酸作为,1个谷-丙转氨酶的活性单位，,血清中,GPT,正常值为,2-40 U/mL。,实 验 步 骤,标准管法测定酶活性：,1,、取干燥试管,4,支，标号,测定管,对照管 标准管 空白管,2,、依次加入试剂，混匀，,37,保温,3,、呈色反应后，,520nm,比色测,OD,值,谷丙转氨酶活性单位,/mL,鼠肝匀浆,=,?,U/ml,方法一：以空白管调,0,，测,A,测定,、,A,标准,、,A,对照,实 验 结 果,A,测定,测定管中生成丙酮酸的质量,= m,标准,A,标准,A,对照,对照管中生成丙酮酸的质量,= m,标准,A,标准,30min,中生成丙酮酸的质量,= m,测定, m,对照,A,测定,-A,对照,= m,标准,A,标准,30min,生成丙酮酸的质量,1,活性单位,= ,2.5,g V,测定,方法二：以空白管调,0,，测,A,标准,以对照管调,0,，测,A,测定,A,测定, m,标准,1,A,标准,活性单位,= (U/ml),2.5,g V,测定,注 意 事 项,保温温度和时间要精确，即酶发挥催化作用的环境要一致。,2,掌握酶活性单位的概念和计算方法,3,微量移液器的使用,分光光度计的使用,1.,打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热,2030min,2.,1,档（空白管），,T,模式调,100%,，显示“,Blank”,、“,100”,3.,拉杆拉至,1,.5,档，,T,模式下调,0%,，显示“,0.00”,4.,换到,A,模式，拉至,2,、,3,、,4,档，读取各个样品的吸光度,拉杆，,1,-4,档,样品池,读数,波长,毛面,光面,1、分清光面、毛面。手应接触毛面，光线从光面通过,2、用溶液润洗2-3次，装至2/3至4/5体积,3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面,比色杯,ALT,测定的临床意义,用本法测定血ALT正常值为,40 U/ml,以下,肝细胞中,ALT,最丰富，当肝脏疾病致肝细胞受损时，,ALT,即大量释放入血液，致使血清中,ALT,活性增高。,测定,ALT,是检查肝功能的重要指标之一。,显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎；,轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。,饮酒、油腻饮食、过劳等因素也会导致,ALT,短暂增高,