无菌检查法演示实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,无菌检查法演示实验,抗生素室,易大为,辽宁省药品检验所,提纲,1.,定义,2.,常见检验品种,3.4.,培养基及培养基的适用性检查,5.,稀释液以及冲洗液,6.,无菌检查法实例,7.,方法学验证试验,1.,定义,:,系指用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。,的意义,:,仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。,2.,常见检验品种,注射剂,(,水针、粉针、油乳注射剂）,眼用以及非注射产品,（手术、烧伤、严重创伤面给药制剂）,无菌封装的原料药,医疗器具和医用材料,3.,培养基,硫乙醇酸盐流体培养基,3035,红色氧化层,（,h,深度的,1/5,）,，,100,水浴加热除去,氧化层，,时间不超过,20,分钟,改良马丁培养基,2328,沸水浴加热,10min,灭菌后放置,3,天的培养基,4.,培养基的适用性检查,无菌性检查,每批培养基随机取不少于,5,支（瓶）,培养,14,天,应无菌生长。,灵敏度检查,硫乙醇酸盐流体培养基,12ml,，,9,支，,4,种菌，,35,培养,3,天；,改良马丁培养基,9ml,，,5,支，,2,种菌，,25,培养,5,天。,结果判断,:,空白管应无菌生长,加菌管均生长良好,菌液制备,（,100 cfu/ml,的菌悬液）,生孢梭菌,64901,铜绿假单胞菌,10104,枯草芽孢杆菌,63501,金黄色葡萄球菌,26003,硫乙醇酸盐流体培养基,灵敏度检查 试验,5.,稀释液以及冲洗液,0.1%,蛋白胨水溶液,稀释液,（,如果蛋白胨溶液浑浊，应过滤,）,聚山梨酯,80-0.1%,蛋白胨水溶液,非水溶液制剂,供试品的冲洗,十四烷酸异丙酯,膏剂和粘性油剂的溶剂，,膜滤除菌,6.,供试品的无菌检查,明确检验数量,与,检验量,根据供试品的情况，确定检样数量,批出厂,or,上市抽检；,固体制剂,or,液体制剂；,直接接种法,or,薄膜过滤法,参考药典附录,90-91,页表,1,，表,2,，表,3,检验流程：取规定量供试品,示例：红霉素眼膏,无菌检查,十四烷酸异丙酯溶解,0.1%蛋白胨水溶液萃取,取水相作为供试液薄膜过滤,0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液冲洗薄膜,加培养基培养14天,上市抽检样品,膏剂和粘性油剂供试品,规格：,2.5g,：,12.5mg,红霉素,薄膜过滤法,（阳性对照增加,1/2,最小检验量）,依据以上的检品信息，查表,3,确定最少检验数量以及最少取样量,已知信息：,本品装量,2.5g,：,300mg,M,5g,最少检验数量,供试品,+,阳性对照：,10+5=15,支,每支最少取样量：,150mg,每支,实际,取样量：,1g,左右,（约为,装量的,2/5,）,共计的接入量,15,克左右,十四烷酸异丙酯的用量约为供试品总接入量的,1,倍,2,倍,左右。,作用：溶解膏剂中的凡士林，使红霉素分散均匀。,十四烷酸异丙酯实际用量,25ml,萃取液：,0.1%,蛋白胨水溶液,200ml,冲洗液：,（检细菌、检真菌、阳性对照）,0.5%,聚山梨酯,80-0.1%,胨水溶液,2100ml,（阴性对照：冲洗液,400ml,）,小结：,薄膜过滤法：,阳性对照增加,1/2,最小检验量,检验数量：,15,支,，每支取样,1,克,，总接入量,15,克,冲洗液用量：,2100ml,，（,700ml,/,筒）,阳性对照,金黄色葡萄球菌（,100,cfu,）,供试品,阴性对照,硫乙醇酸盐流体培养基,改良马丁培养基,结果判断,规定温度，培养,14,天,供试品,a.,无菌生长，同时阳性管有菌生长,符合规定,b.,有菌生长,不符合规定,c.,试验结果无效，须复试,设备环境原因,试验过程染菌,阴性管有菌生长,无菌操作不当,d.,阳性管规定时间内无菌生长 （,23,天内）,须重新进行方法验证,7.,方法学验证试验,当供试品为新的产品或供试品的组分、检验条件发生改变时，需进行方法学验证,直接接种法,（,6,个菌株）,考察供试品是否有抑菌作用,薄膜过滤法,（选择供试品对其生长有抑制作用的菌株做方法学考察）,考察冲洗量以及其他灭活方法的效果,直接接种法,（方法学验证试验,）,取红霉素眼膏一支，无菌操作取出全部内容物，移入含适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，作为供试液；,量取一定体积供试液（相当于固体取样量,150mg,）置相应的培养基中；,(,改良马丁）,接入相应的试验菌,（黑曲霉,or,白色念珠菌）,同时做阳性对照,25,培养,3,5,天，逐日观察,结论,1:,红霉素对,黑曲霉,生长无抑制作用,.,红霉素对,白色念珠菌,生长无抑制作用,.,薄膜过滤法,考察冲洗量,（方法学验证试验,）,试验菌：,(1),生孢梭菌,64901,(2),铜绿假单胞菌,10104,(3),枯草芽孢杆菌,63501,(4),金黄色葡萄球菌,26003,总取样量：,15g/,每株试验菌,1,2,3,+:,对照管,;,1:,没有冲洗,;,2:,冲洗液体积,200ml;,3:,冲洗液体积,400ml.35,培养,24,小时,.,+:,对照管,;,1:,没有冲洗,;,2:,冲洗液体积,200ml.35,培养,48,小时,.,1,2,结论,2:,红霉素对,生孢梭菌,生长无抑制作用,.,红霉素对,铜绿假单孢菌,生长无抑制作用,.,:,对照管,;,1:,没有冲洗,;,2:,冲洗液体积,200ml;,3:,冲洗液体积,400ml.35,培养,72,小时,.,1,2,3,结论,3:,红霉素对,枯草芽孢杆菌,有抑制作用,.,每筒加样量,5g(,相当于红霉素,25mg),冲洗液体积,400ml,枯草芽孢杆菌,48,小时后可见微弱生长,72,小时生长良好,.,3.,在该检验条件下,冲洗,400ml,三天内可检出枯草芽孢杆菌,.,+:,对照管,;,1:,没有冲洗,;,2:,冲洗液体积,200ml;,3:,冲洗液体积,400ml.35,培养,72,小时,.,1,2,3,500:,冲洗液体积,500ml;,700:,冲洗液体积,700ml.35,培养,72,小时,.,再验证试验,结论,4:,红霉素对金黄色葡萄球菌有抑制作用,.,在该检验条件下,冲洗,700ml,残留的红霉素不影响金黄色葡萄球菌的生长,.,