SDS-PAGE原理(中)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,过硫酸铵,分子式,:,(NH4)2S2O8,分子量,:,228.20,性状：,过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，,也可用作单体聚合引发剂,。它几乎不吸潮，由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性，便于储存。另外，它还具有使用方便、安全等优点。,储存及使用注意事项：,过硫酸铵属于非易燃品，但由于能释放氧而有助燃作用，因此必须在一定条件下储存。首先必须存放在干燥、密闭的容器中，其次应避免阳光直射、热源、潮湿等不利因素。另外，一些杂质如脏物、铁锈、少量金属以及还原剂可能引起过硫酸铵的分解，在存放和使用过程中也必须注意。由于潮湿的过硫酸铵粉末及其水溶液有漂白和轻微的腐蚀作用，因此使用过程中应避免眼睛、皮肤和衣物直接与其接触。,过硫酸铵的应用：,过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基,。须新鲜配制,。,过硫酸铵是乳胶或丙烯酸单体聚合液、醋酸乙烯、氯乙烯等产品的引发剂，同时也是苯乙烯、丙烯腈、丁二烯等胶体发生共聚作用的引发剂。,过硫酸铵,-TEMED,（四甲基乙二胺）系统,：在,Acr,和,Bis,的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵,（,NH4,）,2S2O8,产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在,pH 8.8,条件下,7,的丙烯酰胺溶液,30,分钟就能聚合完毕；在,pH 4.3,时聚合很慢，要,90,分钟才能完成。温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升高聚合更快。如将混合后的凝胶溶液放在近,0,的地方，就能延缓聚合。一般来讲，温度过低，有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气，然后再混合。,不连续系统由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。浓缩胶（,pH6.7,，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提高分离效果。分离胶（,pH8.9,，孔径小）通过分子筛效应和电荷效应，把样品中的各组分按分子量和电荷的大小而分开。如果要利用凝胶电泳测定某一蛋白质的分子量就必须将电荷效应去掉或减少到可以忽略不计的程度，使蛋白质泳动率的大小完全取决于分子量。如何去除电荷效应呢？现常用的是十二烷基硫酸钠（,SDS,）。,SDS,是一种阴离子去污剂。在电泳体系中加入一定浓度的,SDS,，,SDS,以一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，从而减低或消除了各种蛋白质分子天然电荷的差异。,十二烷基硫酸钠,SDS,是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与,PAGE,技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。,在有去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳。,SDS-PAGE,只是按照分子大小分离的，而不是根据分子所带的电荷和大小分离的。,SDS,带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用,Mr,差异将各种蛋白质分开。,最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由,Ornstein(1964),和,Davis(1964),设计的,样品和浓缩胶中含,Tris-HCl(pH,6.8),上下槽缓冲液含,Tris,-,甘氨酸,(pH 8.3),分离胶中含,Tris-HCl(pH,8.8),。系统中所有组分都含有,0.1%,的,SDS(Laemmli,1970),。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处,pH,值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，,SDS-,蛋白质复合物成一电位和,pH,值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。,甘氨酸,浓缩效应：,凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液,pH6.7,，分离胶为小孔胶，缓冲液,pH8.9,。在上下电泳槽内充以,Tris,甘氨酸缓冲液,(pH8.3),，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液,pH,值的不连续性。在浓缩胶中,HCl,几乎全部解离为,Cl,-,，但只有极少部分甘氨酸解离为,H2NCH2COO-,。蛋白质的等电点一般在,pH5,左右，在此条件下其解离度在,HCl,和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这,3,种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为,Cl,-,蛋白质,H2NCH2COO-,，故,C1-,称为快离子，而,H2NCH2COO-,称为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成,个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成,条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。,电荷效应,：样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。但在,SDS-PAGE,电泳中，由于,SDS,这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和,SDS,结合后都解离成亚单位，这是因为,SDS,破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。与,SDS,结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中,SDS-,蛋白质复合物都具有相似的形状，使得,SDS-PAGE,电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种,SDS-,蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。,Acr-Bis,产品简介：,40%Acr-Bis(39:1),即为含,40,acrylamide-bisacrylamide,的水溶液，其中,acrylamide,和,bisacrylamide,的比例为,39:1,。,40%Acr-Bis(39:1),常用于配制各种,PAGE,凝胶，例如,EMSA,凝胶、,RPA,凝胶等，可以用于蛋白或核酸等的分离，是实验室的常用储备液。,保存条件：,4,避光保存。,注意事项：,40%Acr-Bis(39:1),有一定毒性，使用时请注意适当防护。,为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。,聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（,Acrylamide,，简写为,Acr,）和交联剂,N,，,N-,甲叉双丙烯酰胺（,N,N-,Methylena,Bisacrylamide,，简写为,Bis,）在催化剂的作用下聚合而成的。,Acr,和,Bis,在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。,