(精品)紫外分光光度法测定核苷酸含量

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二：,核酸的紫外扫描及含量测定,实验目的,1.,了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方法。,2.,掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。,实验原理,核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。,RNA,和,DNA,的紫外吸收峰为,260nm,。一般在,260 nm,波长下，每毫升含,1mg DNA,溶液的光吸收值约为,0.020,，每毫升含,1mgRNA,溶液的光吸收值为,0.022,。故测定待测浓度,RNA,或,DNA,溶液,260nm,的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事先除去。纯净的,RNA,溶液，其,A260/A2802,；纯净的,DNA,溶液，其,A260/A2801.8,。,实验原理,如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液,(20,50mg/mL),，在紫外分光光度计上直接测定。,蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在,280nm,处，在,260nm,处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。,RNA,在,260nm,与,280nm,处的吸收比值在,2.0,以上，,DNA,的比值则在,1.9,左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。,实验器材,1.UV-1000,型紫外可见分光光度计,操作指南：,1.,打开仪器电源，系统自检，并预热,20min,。,2.,选择“光度测量”，按“,enter”,进入吸光度测量。,3.,关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，按“,enter”,进入后，系统自动调整投射比为,100%,和,0%,。,4.,关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，按“,zero”,键调使吸光度,A,为,0.000,。,5.,测量样品。将被测溶液推入光路中，待读数稳定后，读取吸光度。,6.,仪器使用完毕，取出比色皿，洗净、晾干。,7.,关闭电源开关，拔下电源插头，复原仪器。,8.,登记,仪器使用记录表,关于比色皿：比色皿的前后有,2,个光滑面，是用来对准光路的，左右有,2,个粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接触光滑面。比色皿的内部的清洗只能用蒸馏水润洗（用洗瓶），不可用卫生纸或其他物品捅进去擦洗，比色皿的,2,个光滑面一定要保持清洁，如发现有指纹或残液，须用卫生纸轻轻擦拭干净。比色皿是成套发放的，严禁混用，本实验使用的是石英比色皿。使用完毕后先用自来水内外冲洗干净比色皿，再用洗瓶冲洗比色皿的内外表面,1,次，将其粗糙面朝下斜靠在培养皿中。,2.,取样器：参见实验一，,10uL,、,200uL,各,1,支,/,组。,使用指南：接好套头（不漏气）通过旋钮调节容量（如,500,表示,5mL,）用活塞第一挡吸液用活塞第一挡和第二挡放液换套头继续使用。注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。,3.,其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。,实验试剂,1.,蒸馏水,2.,待测的,DNA,溶液,样品测定：,1.,取两个比色皿，一个加蒸馏水做空白对照。一个用来加,DNA,样品。,2.,取,10uL,的,DNA,样品,加入,1990uL,的蒸馏水稀释,200,倍。进行测定含量。,4,清洁紫外分光光度计（尤其是比色槽内）、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂。,