第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,*,第四章 微生物的生化试验和血清学试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,第一节 细菌的生化试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,一、概述,（一）、什么是生化试验?,指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（二） 检验细菌的生化试验范围,1、糖（醇）类代谢试验,2、氨基酸和蛋白质代谢试验,3、有机酸盐和铵盐的利用试验,4、呼吸酶类试验,5、毒性酶类试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（三）生化试验的方法,在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。,在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。,根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。,根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（四）生化试验的注意事项,1、待检菌应是新鲜培养物。培养1824h,。,2、待检菌应是纯种培养物。,3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。,4、应做必要的对照试验,。,5、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌落分别进行试验。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,二、糖醇类代谢试验,（一）糖醇类发酵试验,（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验,（三）V-P试验,（四）甲基红（Methyl Red）试验 MR,（五）七叶苷水解试验,（六）甘油品红试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（一） 糖醇类发酵试验,1.,原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解12种糖醇 ，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,常用的糖醇,单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖,双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖,三糖：棉子糖,多糖：菊糖、肝糖、淀粉,醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法：,用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置361.0,培养13天，每天观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察和记录,记录：,产酸不产气，阳性，以“+”表示,产酸产气，阳性，以“”表示,不产酸产气，阴性，以“-”表示,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,气泡,导管,气泡,气泡,阳性,阳性,阴性,培养基变为黄色,培养基未变色、无气泡产生,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验,1、原理：,细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、方法,取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37培养24h天，每天观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,封油管,未封油管,发酵型,产酸（黄色）,产酸（黄色）,氧化型,不产酸（绿色）,产酸（黄色）,产碱型,不产酸（绿色）,不产酸（绿色）,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（三） V-P试验,1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,（1）奥梅拉（OMeara）法,（2）贝立脱（Barritt）氏法,（3）快速法,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（）奥梅拉法：,将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 培养48h， 每1ml培养液加奥梅拉,OMeara,试剂,0.1ml，摇动试管12min，静置于37恒温箱4h ，或在4850 水浴放置2h后判定结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（2）贝立脱法：,将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361培养2天，每2ml培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361 培养 4h ，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（3）快速法：,将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,（1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P +,（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P -,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（四）甲基红试验（MR）,1、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法：,挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或30 （以30 较好）培养35天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂12滴，立即观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,MR-VP试验原理及照片,V-P,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；,（2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,MR +,MR -,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（五） 七叶苷水解试验,、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe,2+,结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法：,将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于361 培养24h,观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为 +,（2）培养基不变色者，为阴性，记录为 -,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（六） 甘油品红试验,1、原理：,某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法：,取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于361 培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,（1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+；,（2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,复习题,1、什么是生化试验?,2、做生化试验要注意哪些事项？,3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录,5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（一）靛基质（吲哚）试验,（二）H,2,S试验,（三）尿素酶试验,（四）氨基酸脱羧酶试验,（五）苯丙氨酸脱氨酶试验,(六) 明胶（Gelatin）液化试验,三、氨基酸和蛋白质代谢试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（一） 靛基质试验,1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法：,所用试剂:,（1）柯凡克(Kovacs)试剂;,或,（2）欧波试剂,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,将待检菌小量接种于培养基中，于361 培养2448h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。,或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,靛基质试验原理及照片,靛基质+,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+,无红色者，为阴性反应，记-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（二） 硫化氢（H,2,S）试验,1、原理：,某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法：,挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于361培养2448h，观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,培养基底部呈黑色，为阳性，记+,培养基底部无黑色，为阴性，记-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（三） 尿素酶试验,1、原理：,某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法：,挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,尿素酶试验图,阳性,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,培养基变呈粉红色，为阳性，记 +,培养基颜色不变，为阴性，记 -,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（四） 氨基酸脱羧酶试验,1、原理：,某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO,2,。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在361 培养14天，每天观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记 +,试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记 -。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,试验管,对照管,阳性+,阴性-,对照管变黄,试验管变黄,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,阳性反应试验管颜色变化过程,紫色黄色紫色,原理：,对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（1012h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，指示剂显紫色。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,阳性反应试验管颜色变化过程：,紫色,黄色,紫色,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（五） 苯丙氨酸脱氨酶试验,1、原理：,某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在361 培养1824h后，加入氯化铁溶液45滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,试验管立即出现绿色，为阳性，记 +,无色为阴性，记 -。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,加氯化铁试剂,出现绿色+,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（六） 明胶液化试验,1、原理,有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,挑取培养1824h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于361。另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置2030min后，再观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,明胶液化，为阳性，+。,明胶凝固，为阴性，-。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,复习题,1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项,2、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项,3、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果的记录,4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,四、 有机酸盐和铵盐的利用试验,枸橼酸盐利用试验,丙二酸盐利用试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（一） 枸橼酸盐利用试验,1、原理：,某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在361 培养14天，每天观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；,无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,枸椽酸盐试验原理及斜面照片,阳性+,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（二） 丙二酸盐利用试验,1.原理:,某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于361 培养48h，观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+;,培养基无颜色变化,为阴性,记-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,五、 呼吸酶类试验,氧化酶试验,过氧化氢酶试验,硝酸盐还原试验,氰化钾试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（一） 氧化酶试验,1.原理:,氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,试剂,1% -萘酚-乙醇液,1%盐酸二甲基对苯二胺,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,用滴管直接滴加,1%盐酸二甲基对苯二胺,试剂12滴在培养物上,再加入,1% -萘酚-乙醇液12滴,在30秒内判定试验结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,在30秒内,呈蓝色反应,为阳性,记 +,不变色或为红色者,为阴性,记 -,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,成蓝色为+,不变色或为红色为-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（二） 过氧化氢酶试验,1.原理：,某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,产生气泡者，为阳性，记+,不产生气泡者，为阴性，记-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（三）硝酸盐还原试验,1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,试剂,A、对氨基苯磺酸试剂,B、-萘胺试剂,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在361 培养14天，每天取2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,呈现红色，为阳性，记+,若无红色出现，为阴性，记-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（四） 氰化钾试验,1.原理：,氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，361 培养24 48h，观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。,对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,六、毒性酶类试验,溶血试验,链激酶试验,卵磷脂酶试验,血浆凝固酶试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（一） 溶血试验,1、原理：,某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,有二种：,平板法,试管法,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,平板法,将培养物接种于血平板培养基上，361 培养24 48h，观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,溶血试验的溶血类型及现象,（1） （甲型）溶血: 菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。,（2） （乙型）溶血: 菌落周围出现较宽的透明溶血环。,（3）（-丙型）溶血: 菌落周围无溶血环。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,甲型（-）溶血,乙型（-）溶血,丙型（-）溶血,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,试管法,将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，在361 培养16 18h，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,有溶血现象，为阳性，记+；,无溶血现象，为阴性，记 -,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（二） 链激酶试验,1、原理：,A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解 ,为阳性反应。,此试验用于测定链球菌的致病性。阳性反应具有致病性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8 mL生理盐水，混匀后，再加入待检菌36下培养18-24h肉汤培养物0.5 mL和0.25氯化钙0.25 mL，混匀，放37水浴中，2 min观察一次。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2 h内不溶化，继续放置24 h后观察。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,如凝块全部溶化,为阳性+，,凝块24 h仍不溶化,为阴性-,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（三）卵磷脂酶试验,1、原理：,某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,（1）卵黄平板法：,A法：,将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，361 培养3 6h，观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,菌落,白色混浊环，,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,B 法：,先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半，置于36 待干后，将待检菌接种于未涂抗血清的一半卵黄琼脂平板上，再转划已涂过抗血清的一半，361 厌氧培养24 48h，观察结果。,在未涂抗血清的一半平板上，菌落周围形成较大的不透明乳白色混浊区，在涂抗血清的一半平板上，菌落周围无不透明混浊区，为阳性。,两边均无不透明区，为阴性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,菌落周围,无混浊白环,菌落周围,有混浊白环,乳糖卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否产生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制，,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（2）卵黄盐水法,将庖肉培养基培养物经除菌过滤，收集滤液。在两支灭菌试管内，每管加入1%卵黄盐水0.4mL,在一管中加入滤液0.2mL，另一管加入生理盐水0.2mL作对照。在36 水浴中，经2h、 4h、 8h、 24h观察结果。,管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、结果观察与记录,菌落周围形成较大的不透明区，为阳性。,两边均无不透明区，为阴性。,管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。,两管无沉淀者，为阴性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（四） 血浆凝固酶试验,1、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,（1）玻片法：,取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min内,如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性;如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,有凝块,均匀混浊,血浆,生理盐水,血浆凝固酶试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（2）试管法,取灭菌小试管3支，各加入血浆无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml；其余2支作对照管，1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9氯化钠溶0.5ml作空白对照。将3管同时放37温箱或水浴中培养，每0.5 h观察一次， 4 h 内无凝固现象者，观察直至24小时。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,阳性反应,阴性反应,不凝固,少量、零散凝固,明显的块状凝固,巨大块凝固,完全凝固，倒置不流动,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、试管法的结果观察与记录,空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；,均无凝固则为阴性。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,七、 三糖铁（TSI）试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,1、三糖铁试验的原理,如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。,如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,制好的培养基,对照管,斜面红色，底面黄色,培养基全黄色,斜面、底部黄色，并产生H,2,S,斜面红色，底部黄色，产生H,2,S,底面黄色，并产生CO,2,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、试验方法,以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培养1824h，观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,思考题,提问：,志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H,2,S。在培养基上应该产生什么现象？,大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H,2,S。在培养基上应该是什么现象？,沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H,2,S，多数产气，在培养基上应该是什么现象？,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？,答案：,2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,复习题,1、什么是生化试验?,2、做生化试验要注意哪些事项？,3、简述糖酵解试验的原理，写出其试验方法和结果的记录,4、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录,5、简述靛基质（Imdole） (吲哚)试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项,6、简述硫化氢（H,2,S）试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,7、简述尿素酶（Urease）试验的原理，写出其试验方法、结果的记录,8、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理,9、简述氰化钾试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,10、写出溶血试验的溶血类型及现象,11、简述链激酶试验的原理，,12、简述血浆凝固酶试验的原理，并写出玻片法的试验方法,13、简述三糖铁（TSI）试验的试验的原理,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,第二节 血清学试验,血清学反应：,指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,一、抗原与抗体,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（一）抗原,1、抗原的概念,抗原(Ag)：是指凡能刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、抗原的特性,免疫原性,免疫反应性,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（二）抗体,1、抗体,是指机体内的淋巴系统细胞在抗原物质的激发下，所合成的一种具有特异性免疫功能的球蛋白(免疫球蛋白)。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、抗体的理化性质,（1）抗体是球蛋白,（2）免疫球蛋白,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,图2-1 兔血清电泳分离图,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,其后，经对不同免疫血清的电泳分析，超速离心分析和分子量测定等方法，发现大部分抗体活性存在于球蛋白内，但有小部分抗体活性可存在于球蛋白内。它们的离心常数分别为7S和平共处9S，分子量分别为16万和万。因此它们分别被命名为7S球蛋白分子（16万）19S,2巨球蛋白分子(2M,90万)和2A球蛋白分子，所以从早期对抗体性质的研究证明抗体不是由均质性球蛋白组成，而是由异性球蛋白组成。,图2-2 不同类免疫球收白的电泳分离图,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（三）抗原抗体反应,抗原抗体反应：,是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,1、抗原抗体反应的化学本质,（1）结构基础,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（2）、化学变化：, 四种分子间作用力参与并促进Ag-Ab的反应,电荷引力,范登华引力,氢键结合力,疏水作用,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,抗原抗体反应的胶体状态的变化过程总结如下。,Ag+Ab (AgAb) n,特异性结合 AgAb 电解质,亲水胶体,带电荷的疏水胶体,疏水胶体凝集,理化性质改变：亲水胶体转化为疏水胶体,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2. 反应过程：,不可见阶段,可见阶段,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,二、血清学反应的特点：,1、具有特异性与交叉性,2、具有敏感性,3、具有定理特性,。,4、反应的两个阶段性,5、反应的稳定性与可逆性的。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,图9-1沉淀反应中没淀量与抗原抗体的比例关系,Ag：抗原；Ab：抗体,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,三、影响血清学试验的的因素,1.抗体,2.抗原,3. 电解质:,常用:0.85氯化钠或各种缓冲液,作用:中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。,4. 酸碱度: pH为68进行,5. 温度:,一般以1540为宜，最适为37，,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,四、 血清学反应的种类,1、凝集反应,2、沉淀反应,3、中和反应,4、标志抗体技术,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（一）凝集试验,颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,鲜血者红细胞,受血者血清,O型(抗A、抗B),A型(抗B),B型(抗A),AB型(无),O型,-,-,-,-,A型,+,-,+,-,B型,+,+,-,-,AB型,+,+,+,-,注:“+”表示有凝集反应,“-”表示无凝集反应,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（二）、 凝集试验的方法,1直接凝集法,2间接凝集法,3抗球蛋白试验,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（三）、直接凝集试验,1、玻片凝集法,（1）原理:用已知抗体作为诊断血清，来检测未知抗原,以鉴定相应的抗原。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（2）方法步骤:,、于洁净玻片的一端加诊断血清,1,滴，另一端加生理盐水,1,滴作为阴性对照。,、用接种环取待检菌或血细胞的悬液分别涂于诊断血清和生理盐水中。,、轻轻转动玻片，使其充分混匀，静置数分钟，观察结果。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,抗血清,生理盐水,待检菌,凝集者为+,未凝集,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,（4）诊断血清及类型,诊断血清,：将已知的抗原注射于动物体，使其产生相应的抗体，采出动物的血液，分离出含有大量抗体的血清，称为诊断血清（或抗血清、免疫血清）,抗O血清,：用菌体抗原（O抗原）免疫动物后所获得的血清。,抗H血清,：用鞭毛抗原（H抗原）免疫动物后所获得的血清。,表面抗原血清,：用含有表面抗原的菌体免疫动物后所获得的血清。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,多价诊断血清,：,用含有两种（型）的菌体免疫动物后所获得的血清。,单价诊断血清,：只,含有一种（型）特异性抗体的血清。,因子诊断血清,：,把含有多种,抗体的混合免疫血清，用具有共同抗原成分的有关细菌将其共同抗体吸收，只留下一种或几种所需的特异性抗体的血清。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,诊断血清的使用与保存,保存：210 冰箱；,无菌取用，有效期2年,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,操作方法,1、制备待检菌悬浮液：,1210,8,个/ml,，,（四）试管凝集法,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,2、稀释待检血清：,取10支试管，依次编号，用吸管加入生理盐水，第1管0.9ml，其余各管均为0.5ml。然后吸取0.1ml待检血清加入第1管内，吹打3次，使混匀，该管含1:10稀释血清。接着用同一吸管从第1管吸出0.5ml加入第2管内，按上法混合，以同法连续稀释至第9管，从该管内吸取0.5ml弃去。如此每管内所含受检血清浓度为前一管的一半，即1:10、1:20、1:401:2560，最后一管留作对照。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,3、,加入抗原：各管加入诊断菌液,0.5ml,，振摇试管架，充分混匀,4、,保温静置：鞭毛凝集反应最好先37静置2h，初步判读结果，然后移放冰箱过夜，再次判读。菌体凝集试验需较高的温度和较长的时间，最好是放37后，移置55 24h。而布鲁菌凝集反应以放置552天最佳。,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,试管号,1,2,3,4,5,6,7,8,9,对照,生理盐水（ml),0.9,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,稀释血清（ml),0.1,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,血清稀释度,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280,1:2560,菌悬浮液（ml),0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,血清最后稀释度,1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280,1:2560,1:5120,试管凝集试验稀释步骤,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,结果记录,（1）完全凝集：凝集块完全沉于管底。上层液体澄清，以+记录,（2）凝集块沉于管底。上层液体稍混浊，以+记录,（3）部分凝集，上层液体混浊以+记录,（4）很少凝集，液体较混浊以+记录,（5）与对照管相同，无变化，以-记录,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,复习题,1、血清学反应、抗原、抗体、抗原抗体反应的概念,2、影响血清学试验的因素有哪些？,3、血清学试验,常用的,电解质,有哪些，有什么,作用？,4、写出血清学试验中,玻片凝集法的原理和试验的方法步骤。,5、诊断血清、抗O血清、抗H血清、,多价诊断血清、单价诊断血清、因子诊断血清的概念,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,谢谢合作,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,演讲完毕，谢谢听讲,!,再见，see you again,3rew,10/5/2024,第四章微生物的生化试验和血清学试验第四章微生物的生化试,