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马冬冬,2,HPLC,基本原理和特点,液相色谱仪器部件,实验操作与应用,日常维护,方法学的建立,基本原理和特点,基本原理：溶于流动相,(mobile phase),中的各组分经过固定相时，由于与固定相,(stationary phase),发生作用,(,吸附,，,分配,，,离子吸引,，,排阻,，,亲和,),的大小,，,强弱不同,，,在固定相中滞留时间不同,，,从而先后从固定相中流出,。,特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。,HPLC的分类,按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法,(NPC),和反相色谱法,(RPC),。,正相色谱法：采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（如正已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物。,反相色谱法,：一般用非极性固定相（如,C18,、,C8,）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂，,极性物质先出,。,高效液相色谱仪组成,输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,数据记录处理系统,溶剂,色谱泵,自动进样器,HPLC,色谱柱,检测器,废液,数据处理系统,液相色谱流程图,一些商品化仪器,脱气装置,四元泵,柱温箱,样品盘,检测器,流动相,溶剂,棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。,启动液相色谱仪器的流程,开启,HPLC,系统各个设备的电源,打开泵、自动进样器、检测器电源，打开计算机启动“,1260,联机工作站”，待工作站图形颜色为绿色,表明仪器已就绪。,排气泡,打开排气阀，将流速调至,5ml/min,，排气,5min,；待流速降为,0,，拧紧排气阀。,80%,甲醇（过滤、超声,15min,）冲洗系统,使用,80%,的甲醇溶液冲洗系统至少,30min,，流速为,1ml/min,，待基线平稳即可进行下一步操作。,注意：,观察柱压是否稳定，若不稳定出现大幅度柱压下降现象，很有可能是系统发生漏液，优先排查色谱柱的连接处是否漏液，其次是排气阀处，最后是观察其他管道连接处；若流动相中含有离子，,80%,甲醇冲洗系统之后，使用,10%,甲醇继续冲洗系统至少,30min,。否则，会有离子析出，堵塞管路。,柱压应小于,10bar,，如若过大，应更换溶剂出口过滤白头,启动液相色谱仪器的流程,流动相冲洗系统,流动相配制后，先使用过滤装置过滤，然后超声,15min,，排除气泡干扰。流速,1ml/min,，使用流动相冲洗系统至少,30min,，待基线平稳即可进行下一步操作。,进样测定,具体操作如下：点击“序列”,-“,序列表”,-,输入相关信息确定（样品瓶、样品名称、方法名称,-TEST,、进样次数、进样量）,-“,开始序列”。待进样结束后，进行下一步操作。,注意：,在进样前，最好用,100%,甲醇进行洗针，以防进样针中残留的其它样品影响实验结果。,水相走,A,、,D,泵，有机相走,B,、,C,泵，可防止缓冲盐析出,启动液相色谱仪器的流程,80%,甲醇冲洗系统,使用,80%,的甲醇溶液冲洗系统至少,30min,，流速为,1ml/min,，待基线平稳，将流速降为,0,，即可进行下一步操作。,注意：若流动相中含有离子，先使用,10%,甲醇冲洗系统至少,30min,，后使用,80%,甲醇冲洗系统。,关闭系统,点击工作站右下角“关闭”按钮，待仪器显示未就绪，关闭,1260,（联机），关闭电脑，关闭液相各模块电源。拔掉总电源即结束。,流动相的选择,甲醇,质子化溶剂 氢键供给者,洗脱能力较乙腈弱,粘度较乙腈高,低紫外波长下有吸收,乙腈,非质子化溶剂 氢键接受者,洗脱能力较甲醇强,粘度较甲醇低,低紫外波长下透光性好,常用溶剂的极性及截止波长,反相,液相色谱，若希望出峰时间早，可以增加流动相中有机相的比例；,若,希望出峰时间晚,，,可以增加流动相中水相比例（有机相一般不低于,5%,）,。,甲醇的极限波长为,210,nm,，,因此，检测波长较小时,，,应该选用乙腈而非甲醇；样品稀释最好选用流动相，可以避免溶剂峰的干扰。,溶剂,水,甲醇,乙醇,异丙醇,乙腈,四氢呋喃,极性常数,1.00,0.95,0.88,0.82,0.65,0.57,截止波长,170,210,210,210,190,210,流动相的选择,80%,甲醇冲系统基线不平,为了得到较好的分离效果，可以在流动相中加入一些少量的有机溶剂，如三乙胺来调节峰形变“瘦”，减少拖尾现象。,加入缓冲盐，调节流动相的,pH,值或离子强度，以改变组分的保留时间达到分离效果等。,一般情况下，大家如要建立色谱条件，,应先去查询,中国药典,及文献资料，再进行适当的修改。,流动相的调节,过滤：,0.45um,或更小孔径滤膜,目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。,注意：不同的试剂分别过滤，过滤后再混合；滤膜的选择，不要混用；要现用现处理，尤其是水和缓冲液,脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡,气泡对测定的影响：,泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积,柱中气泡使流动相绕流，峰变形,检测器中的气泡产生基线波动,流动相的处理,流动相的保存,有机溶剂流动相：,室温下密封，避光保存,缓冲盐流动相：,当日现配现用：,低温下密封保存，一般不超过,3,天,防止微生物生长,有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：,低温密封保存,防止有机相的挥发,梯度洗脱,梯度洗脱是指在一个分析周期中，按一定的程序连续改变流动相中溶剂的组成（如溶剂的极性、离子强度、,pH,值等）和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离。是分析,复杂混合物,特别是分离保留性能相差较大的混合物的极为重要的手段。,优点,：改善峰形，提高柱效,缩短分析时间,强保留成分不易残留在柱上,缺点,：会引起基线漂移,有时重现性差,故,需严格控制梯度洗脱的实验条件,。,能等度洗脱绝不选择梯度洗脱,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,进样器,检测器,检查溶剂过滤器,查看过滤器是否变色,临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常,清洁溶剂过滤器,将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂然后将过滤器放在装有,浓硝酸（35）,的烧杯里浸一小时，不要使用超声波清洗,用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器，将过滤器重新装好。,建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次。,日常维护,日常维护,严重污染的溶剂出口过滤芯,日常维护,溶剂出口过滤白头,日常维护,泵的保养：,使用流动相尽量要清洁；,进液处的砂芯过滤头要经常清洗；,流动相交换时要防止沉淀；,避免泵内堵塞或有气泡；,每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；,灯的保养：,在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器,柱的保养：,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；,使用预柱，,保护柱堵了，异丙醇超声清洗保护柱柱芯即可；,当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；,要注意流动相的脱气；,避免使用高粘度的溶剂作为流动相；,进样样品要提纯；,严格控制进样量；,每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；,每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；,若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；,（,用,20%,甲醇溶液清洗,10,个柱体积，保存在,90%,的甲醇溶液中）,日常维护,HPLC分析方法的建立及验证,目的,：证明采用的方法适合于相应检测的要求。,方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。,验证内容：专属性、线性范围、灵敏度（检测限、定量限）、准确度、精密度（重复性
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