实验四 外源基因的多重PCR检测

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,外源基因的多重,PCR,检测,实验目的,通过多重,PCR,，比较、分析影响多重,PCR,的主要因素，掌握解决方法。,掌握多重,PCR,引物设计的原则和方法，确立多重,PCR,方法快速检测转基因植物中外源基因整合的条件，为更深一步应用多重,PCR,检测技术奠定基础,一 多重,PCR,技术的基本原理,多重,PCR,方法目前在植物生物学研究上应用非常广泛，包括植物种质鉴定，植物病毒的检测和分子育种。多重,PCR,的关键是引物设计，主要原则就是避免引物内部形成发卡结构，引物及引物之间在扩增过程中产生二聚体。其他条件例如模板纯度，退火温度也能够影响,PCR,扩增效果。,PCR,由变性,-,退火,-,延伸三个基本反应步骤构成。类似于,DNA,的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。,二,PCR,的反应动力学,DNA,扩增量呈指数上升。,反应最终的,DNA,扩增量可用,Y,(1,X)n,计算。,Y,代表,DNA,片段扩增后的拷贝数，,X,表示每次扩增效率的平均值，,n,代表循环次数。,平均扩增效率的理论值为,100%,，但在实际反应中平均效率达不到理论值。,反应初期，靶序列,DNA,片段的增加呈指数形式，随着,PCR,产物的逐渐积累，被扩增的,DNA,片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期,(Plateau),。,平台期产生的因素,dNTP,和引物浓度下降,酶与模板的比例下降，能参与反应的 酶分子数下降,多次循环后酶与,dNTP,的稳定性下降,非特异产物及引物二聚体比例增加,产物浓度高时变性不完全，影响引物的延伸，并产物浓度过高,10,8M,时，降低,Taq,酶的延伸与加工能力。,设置变性,-,退火,-,延伸三个温度点,设置变性,-,退火,-,延伸三个温度点,标准反应中采用三温度点法，双链,DNA,在,90,95,变性，再迅速冷却至,40,60,，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至,70,75,，在,Taq,DNA,聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸,对于较短靶基因（长度为,100,300bp,时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用,94,变性，,65,左右退火与延伸,变性温度与时间,变性温度低，解链不完全是导致,PCR,失败的最主要原因,一般,93,94lmin,足以使模板,DNA,变性,若低于,93,则需延长时间,但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,此步若不能使靶基因模板或,PCR,产物完全变性，就会导致,PCR,失败,退火,(,复性,),温度与时间,退火温度是影响,PCR,特异性的较重要因素,变性后温度快速冷却至,40,60,，可使引物和模板发生结合。由于模板,DNA,比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度,对于,20,个核苷酸，,G+C,含量约,50%,的引物，,55,为选择最适退火温度的起点较为理想,引物的复性温度,通过以下公式帮助选择合适的温度,Tm,值（解链温度）,=4,（,G+C,）,2,（,A+T,）,复性温度,=Tm,值,-,（,5,10,）,在,Tm,值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高,PCR,反应的特异性,复性时间一般为,30,60sec,，,足以使引物与模板之间完全结合,延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在,70,75,之间,常用温度为,72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。,延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb,以内的,DNA,片段，延伸时间,1min,（,足够）,3,4kb,的靶序列需,3,4min,扩增,10Kb,需延伸至,15min,延伸进间过长会导致非特异性扩增,对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,引物设计,引物设计,根据,bt,，,npt,II,和,gus,序列特征，使用,oligo6.67,结合,primer premier 5.0,软件设计三对引物，用于多重,PCR,和单重,PCR,扩增。引物参见,表,1,。,表,1,扩增,DNA,模板引物对的方向、长度、,Tm,值、,GC,含量以及理论上扩增产物的大小等相关参数,Amplified gene,扩增基因,Polarity,方向,Name,名称,primer sequence,引物序列,Lengh,长度,Tm,Tm,值,GC%,GC,含量,Product,size(bp,),产物长度,Bt,+,Bt-F,5aacggtagattcgctggat3,19,54.5,47.4,247,-,Bt-R,5cagaagttccagagccaag3,19,52.7,52.6,NptII,+,NptII,-F,5tccggccgcttgggtggaga3,20,59.8,58.3,449,-,NptII,-R,5tggcgcgagcccctgatgct3,20,58.7,58.8,Gus,+,GUS-F,5gcaactggacaaggcacta3,19,53.9,52.6,668,-,GUS-R,5agcgtcgcagaacattaca 3,19,54.7,47.4,常规引物对不适于多重,PCR,检测，因为扩增过程中引物之间的干扰，产物片段长度的重叠都会影响多重,PCR,的准确性。为了防止在,PCR,过程中产生非特异性扩增，每对引物的设计都应当有相近的,Tm,值，,GC%,含量和长度，产物大小能够保证相差大于,150bp,，这样可以在琼脂糖凝胶电泳时产生可以区分的条带。引物产生的发卡结构及二聚体的形成检测由程序,(,http:/,bioweb,.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfoldsimple.html,),完成。,检测三个外源基因是否整合在基因组中反应体系：,三对引物应用于,PCR,扩增反应中，体系,30L,，含,10PCRbuffer3L,，,dNTPmixture,(2.5mM)2.5L,，引物,(5M),各,2L,，模板,DNA(50ng/L)2,L,，,Taq,酶,(5U/L)0.3U,，双蒸水补足,30L,。时间设置,94,预变性,5min,；,94,变性,30s,，退火,30s,，,72,保持,45s,，共运行,30,个循环；,72,延伸,10min,，梯度,PCR,采用如下设置：,94,预变性,5min,；,94,变性,30s,，,55,6530s,，,72,保持,45s,，共运行,35,个循环；,72,延伸,10min,，确定最佳的退火温度，产物经,1.0%,琼脂糖凝胶电泳分析。,10PCRbuffer 3L,dNTPmixture,(2.5mM)2.5L,引物,(5M),各,2L,模板,DNA(50ng/L)2,L,Taq,酶,(5U/L)0.3U,双蒸水补足至,30L,梯度,PCR,采用如下设置：,94,预变性,5min,；,94,变性,30s,，,55,6530s,，,72,保持,45s,，共运行,35,个循环；,72,延伸,10min,。,本次实验时间设置,94,预变性,5min,；,94,变性,30s,，,55,退火,30s,，,72,保持,45s,，共运行,30,个循环；,72,延伸,10min,，,检测三个外源基因是否整合在基因组中反应体系：,扩增条件设置,样品：待测转基因植物,DNA,阳性对照：质粒,DNA,阴性对照：未转化的同一无性系植株,多重,PCR,反应条件,94,预变性,3min,94,变性,30s,58,复性,45s 30,个循环,72,延伸,45s,72,延伸,10min,4,终止反应,反应结束后，取,3-5L,进行,1.0%,琼脂糖凝胶电泳，剩余产物置,4,保存。,结合自己的实验进行结果分析,多重,PCR,在设计和应用时应注意哪些问题。,