代谢控制发酵的基本思想2

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 代谢控制发酵的基本思想,第二讲,1,基本思想：,一 切断支路代谢,二 解除菌体自身的反馈调节,三 去除终产物,四 增加前体物的合成,五 特殊调节机制的利用,六 条件突变株的应用,七 选育不生成副产物的菌株,八 选育生产代谢拮抗物质的菌株,2,四,.,增加前体物的合成,通过选育某些,营养缺陷型,或,结构类似物抗性突变株,以及,克隆某些关键酶,的方法，增加目的产物的前体物的合成，有利于目的产物的大量积累。,3,(1),在分支合成途径中，切断目的产物外的其他控制共用酶的终产物分支合成途径，增多目的产物的前体，使目的产物的产量提高,。,4,例1,预苯酸,苯丙酮酸,L-,苯丙氨酸,前酪氨酸,L-,酪氨酸,预苯酸脱氢酶,PD,预苯酸脱水酶,PT,PD,缺陷型,5,例,2,：,在赖氨酸的发酵育种上，对育出的解除了赖氨酸反馈调节的突变株，通过增加丙氨酸营养缺陷等遗传标记，提高产量。,6,葡萄糖,丙酮酸,丙氨酸,天冬氨酸,天冬氨酸,半醛,苏氨酸,二氢吡啶,二羧酸,赖氨酸,亮氨酸,协同反馈抑制,L-,氨基酸,-,酮酸,A,B,乳糖发酵短杆菌中赖氨酸,丙氨酸的生物合成途径及其调节,A,：,L-,氨基酸丙酮酸转氨酶,B,：,天冬氨酸,-,脱羧酶,反馈阻遏,反馈抑制,抗,S-,（,2-,氨乙基）,-L-,半胱氨酸,丙氨酸缺,陷型,7,（,2,）,目的产物的生物合成从,别的终产物（氨基酸等）,开始时（,即别的终产物是目的产物生物合成的前体,），除设法解除目的产物自身合成的反馈调节外，也应该设法,解除其前体物合成,的调节。,8,举例：,选育,异亮氨酸菌株,时，苏氨酸是异亮氨酸的前体物。为了积累异亮氨酸，除设法解除异亮氨酸自身合成的反馈调节外，还需设法,解除苏氨酸,的反馈调节，增加异亮氨酸的产量。,9,葡萄糖,天冬氨酸,天冬氨酸半醛,高丝氨酸,苏氨酸,-,酮丁酸,异亮氨酸,赖氨酸,蛋氨酸,高丝氨酸脱氢酶,抗苏氨酸结构类似物,2-,氨基,-3-,羟基戊酸（,AHVr,）,突变株,10,（,3,）在生物合成途径中,分支点的,分解途径的代谢流,增强，使分支点处的中间产物增多，导致目的产物的积累增加。,11,葡萄糖,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰,CoA,乙酸,乙酰磷酸,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,草酰乙酸,苹果酸,反丁烯二酸,琥珀酸,a-,酮戊二酸,乙醛酸,乙酰,CoA,L-,谷氨酸,黄色短杆菌由葡萄糖和乙酸合成谷氨酸的,代谢,途径,磷酸转乙酰酶,磷酸转乙酰酶,12,（,4,）利用基因工程技术，将生物合成途径中的关键酶基因克隆到 多拷贝质粒上，使其大量扩增，从而也就增加了目的产物的前体物的合成。,近年来已见报道的有苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和谷胱甘肽等氨基酸育种应用重组,DNA,技术提高产量。,13,有报道将具有,结构类似物抗性,的,E.coli,K12,菌株中,Thr,操纵子与,pBR322,质粒,相结合，获得重组质粒再转移给适当的受体菌，由于基因扩增，此基因工程菌可产苏氨酸达,55g/L,，,比原株提高,3,4,倍。,14,一个细胞在代谢调节中产生阻遏物的量仅满足于和操纵基因结合，如果细胞中含有,很多的操纵基因和结构基因,，那么一个调节基因所产生的阻遏物就不足以阻遏全部操纵子的活力，因而逃避了调节基因产生的阻遏作用，称为“,逃避合成,”，这是最直接的提高目的产物产量的方法之一,。,15,例如，,-,半乳糖苷酶、青霉素酶、氯霉素转酰酶和天冬氨酸转氨甲酰酶，可借助含有相应结构基因的质粒转移给受体培养物来增加产量；利用含有对,苯丙氨酸合成酶编码的结构基因,的转导噬菌体可使该酶产量增加,15,倍。,16,小结：,增加前体物合成的途径：,切断分支代谢途径,解除前体物的反馈调节,增强分支点代谢流,增加关键酶的表达,17,五、特殊调节机制的利用,1.,多种产物控制机制的利用,2.,平衡合成的利用,3.,代谢互锁的利用,4.,优先合成的变换,18,1.,多种产物控制机制的利用,在多种产物控制机制中，只有当反馈控制有关的,全部终产物同时过剩存在时，才产生完全的或最大的反馈控制,。任一种终产物过量时，完全不产生或产生部分的反馈控制。利用这种特性，可设法控制目的产物以外的终产物供给量，使目的产物积累。,19,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酰半醛,二氢吡啶二羧酸,赖氨酸,高丝氨酸,O-,乙酰高丝氨酸,蛋氨酸,O-,磷酸高丝氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,天冬氨酸激酶,高丝氨酸脱氢酶,高丝氨酸激酶,黄色短杆菌赖氨酸的合成调节,TD,HT,反馈控制,高丝氨酸脱氢酶缺陷,高丝氨酸激酶缺陷,20,2.,平衡合成的利用,A,B,C,D,E,F,G,a,b,底物,A,经分支合成途径生成,E,和,G,，,由于,a,酶的活性大于,b,酶，结果优先合成,E,。,E,过量,后就,抑制,a,酶,，使代谢转向,G,。,G,过量,后就会,拮抗或逆转,E,的反馈抑制,作用，结果使代谢流转向合成,E,，,如此循环不已。,21,在平衡合成机制中，由于第二个终产物的过剩逆转反馈控制，所以，尽管存在反馈控制也能积累目的产物。,22,举例：,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰,CoA,柠檬酸,草酰乙酸,天冬氨酸,黄色短杆菌中天冬氨酸与乙酰,CoA,的平衡合成,反馈抑制,逆转反馈抑制,丧失柠檬酸合成酶的突变株,23,所谓代谢互锁（,metabolic interlock,），,就是从生物合成途径来看，似乎是受一种,完全无关的终产物,的控制，它只是在较高浓度下才发生，而且这种抑制（阻遏）作用是,部分性的，不完全的,。,3.,代谢互锁的利用,24,谷氨酸,谷氨酰磷酸,谷氨酸激酶,脯氨酸,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,赖氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,苏氨酸脱氨酶缺陷,草酰乙酸,ATP,黄色短杆菌异亮氨酸缺陷型生产脯氨酸,25,例：黄色短杆菌赖氨酸的合成调节,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酰半醛,二氢吡啶二羧酸,赖氨酸,高丝氨酸,蛋氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,乳糖发酵短杆菌赖氨酸及亮氨酸的生物合成,天冬氨酸激酶,二氢吡啶二羧酸合成酶,亮氨酸,反馈抑制,反馈阻遏,抗,AEC+leu,-,26,代谢互锁不仅具有,抑制与阻遏,作用，还发现具有,激活,作用。,如：枯草芽孢杆菌色氨酸的生物合成途径中，,氨茴酸合成酶,的活性被,组氨酸,激活，使用枯草芽孢杆菌的抗,5-,氟色氨酸突变株生产色氨酸时，通过添加组氨酸使色氨酸产量由,2g/L,提高到,3.4g/L,。,27,4.,优先合成（,preference synthesis,）,的变换,底物,A,经过分支途径生成两种终产物,E,和,G,，,由于,a,酶的活性远大于,b,酶的活性，结果优先合成,E,；,E,升高到一定浓度，抑制,a,酶，使代谢转向合成,G,，,G,量增加后抑制,c,的活性。,A,B,C,D,E,F,G,a,b,c,28,在分支合成途径的调节中，因为在分支点处的优先合成与反馈控制一起完成重要的功能，所以优先合成的转换会引起一种终产物的过剩合成。,29,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酰半醛,二氢吡啶二羧酸,赖氨酸,高丝氨酸,O-,乙酰高丝氨酸,蛋氨酸,O-,磷酸高丝氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,天冬氨酸激酶,高丝氨酸脱氢酶,高丝氨酸激酶,黄色短杆菌赖氨酸的合成调节,TD,反馈控制,加过量蛋氨酸,5g/L,突变活性降低,1/3,20g/L,30,六、条件突变株的应用,像,温度敏感性突变,、,链霉素依赖性突变,和,低温敏感性突变,等，因环境条件的不同能显示突变型特性的改变，称为条件致死突变（,conditional lethal mutation,）。,主要是蛋白质的结构基因发生突变。,31,温度敏感性突变,很多微生物可以在,20-50,温度范围内生长。,通过诱变可以得到在低温下生长，而在高温下却不能生长繁殖的突变株，这样的突变即是温度敏感型突变。,32,温度敏感型突变的位置常发生在酶的结构基因上，致使一个氨基酸被另一个氨基酸代替。,温度敏感突变株高温下酶失活，因而不能生长。改变温度，酶活性在,0,100,之间变化，但是难以恢复到,100,野生型活性。,33,如果该酶是蛋白质，维生素或核苷酸生物合成途径上的酶，则该突变株高温下就是一种营养缺陷型。,例：如果突变位置发生在为亮氨酸合成酶系编码的基因中，使翻译出来的酶对温度敏感，则高温时就不能合成亮氨酸，即成为亮氨酸缺陷型。,34,例如：,由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌经诱变处理得到温度敏感变异株,Ts88,，,30,培养时能正常生长，,40,时死亡,但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸,(,而野生型却受生物素的反馈抑制,).,在富含生物素的培养基中进行发酵时,:,先在,30(,允许条件,),中进行培养以得到大量菌细胞,适当时间后提高温度,(40,非允许条件,),即能获得谷氨酸的过量生产,35,在抗生素和酶制剂的工业生产中，为了改良菌株，提高产量，常会丧失菌株的孢子形成能力，造成保存菌株与传代的困难。此时，可选育在高温下丧失孢子形成能力，高生产性的温度敏感型突变株，高温下生产，低温下形成孢子，进行保存与传代。,36,