高效液相色谱HLPC(精品)

,高效液相色谱,（,high performance liquid chromatography,HPLC）,中南大学湘雅医学院医学检验系,徐克前,一基本原理,（一）定义,HPLC,是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同，进行连续的、无数次的交换和分配而达到分离的过程。,组成：,固定相柱内填料,流动相洗脱剂,（二）固定相,（,stationary phase),和 流动相（,mobile phase,）,(1)化学键合相硅胶,化学官能团键合到硅胶表面,OH OH,|,硅胶（,SiO,2,nH,2,O,）,Si,O,Si,|,键合相反应,R,1,|,Si,OH +X,Si,R,Si,O,Si,R +HX,|,R,2,硅胶 有机硅烷 键合相,X:,Cl、CH,3,O、C,2,H,5,O,等,R:,烷,C,8,(C,8,H,17,)、C,10,(C,10,H,21,)、C,18,(C,18,H,37,),等,R,1,R,2,:,Z、CH,3,等,(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料（,octadecylsilyl,ODS,）,万能柱,即,C,18,柱或,ODS,柱,主要用于反相,HPLC,中，适用于各种类型的生物分子,(3),短链烷基键合物,短链烷基（,c,3,、,c,4,等）,大孔硅胶,键合物,适用于氨基酸、小肽等生物小分子,(4)键合到基质上的官能团性质,反相柱：,填料是非极性的，官能团为烷烃，,如,C,18,、C,8,、C,4,等,正相柱：,填料是极性的，官能团为,CN、NH,2,等,离子交换键合相：,阳离子官能团,：,SO,3,H、,COOH,等,阴离子官能团,NH,2,、R,4,N,+,等,2、流动相,（,mobile,phase）,流动相选择原则：,1.样品易污，且溶解度尽可能大2.化学性质稳定，不损坏柱3.不妨碍检测器检测分析4.粘度低，流动性好5.易于从中回收样品6.无毒或低毒，易于操作7.易于制成高纯度，即色谱纯8.废液易处理，不污染环境,反相色谱常用流动相及冲洗强度,H,2,O,甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃,最常用组成：甲醇/,H,2,O、,乙腈/,H,2,O,洗脱顺序：极性物先洗脱下来,正相色谱常用流动相及冲洗强度,正乙烷乙醚,乙酸乙酯异丙醇,二、分离模式,正相,HPLC,反相,HPLC,离子交换,HPLC,凝胶,HPLC,亲和,HPLC,（一）正相,HPLC,（normal phase HPLC,NP-HPLC）,固定相,：极性吸附剂（或极性键合相），如硅胶、,Al,3,O,2,流动相：,非极性或弱极性溶剂，如己烷、庚烷等,洗脱顺序：,非极性、弱极性、极性,应用：,石油化工产品、染料、农药、医药、有机酸、有机碱等,（二）反相,HPLC,（reverse phase HPLC,RP-HPLC）,固定相,：非极性物质，如,C,18,(ODS)、,C,10,、C,8,、C,6,、C,4,、C,2,流动相：,极性溶剂，如,甲醇/,H,2,O、,乙腈/,H,2,O,等,洗脱顺序：,极性、弱极性、非极性,应用：,蛋白质、多肽等,（三）离子交换,HPLC,（ion-exchange HPLC,IE-HPLC）,原理：,用离子交换剂作固定相，根据不同组分在一定,pH,下，组分电荷性质和数量不同而分离的技术,分类：,阳离子交换树脂：,含酸性基团：,阴离子交换树脂：,磺酸基、磷酸基等,合碱性基团：,季胺基、叔胺基等,应用：,核酸、蛋白质、氨基酸等,（四）凝胶,HPLC,（,gel HPLC,G-HPLC）,原理：,基于分子大小和形状的差异进行分析的技术,固定相：,交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶,流动相：,水、乙醇、丙酮等,应用：,核酸、蛋白质、酶、多糖等,（五）亲和,HPLC,（affinity HPLC,AF-HPLC）,原理：,利用生物大分子间专一的亲和力进行分离的技术,固定相：,基质（琼脂糖凝胶等）交联配基（亲和性）,应用：,酶、抗体、抗原、受体等,三、,HPLC,仪器,HPLC,仪 一般由,输液系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录和数据处理系统及计算机,等几部分组成,（一）输液系统：,贮液及脱气装置,梯度洗脱装置,高压输液泵,梯度洗脱装置,高压输液泵,（二）进样系统：,（三）柱系统：,（四,）,检测器：,与泵、柱组成,HPLC,的三大关键部件,1.紫外吸收检测器,2.荧光检测器,4.示差折光检测器,表.,HLPC,常用检测器,检测器 原理 检测下限,（,g/ml）,检测范围,紫外检测器 具有紫外吸收性质 10,-7,荧光检测器 具有荧光物质 10,-14,电化学检测器 具有电解活性物质 10,-12,示差折光检测器 与流动相折光率不同 10,-7,糖类等,蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、激素等,多环芳烃、氨基酸、维生素等,食品、环境、生化、医学等,（五,）,不同,HPLC,产品介绍：,高效液相色谱仪器（）,高效液相色谱仪器（2）,高效液相色谱仪器（3）,高效液相色谱仪器（4）,四、定性和定量,定性分析,保留值定性：,比较未知峰与标准物的保留值,收集未知峰洗脱液定性：,物理分析，化学分析，生物学分析,联机定性：,液质联用（）,液红联用（）,定量分析,分析检测物质的量（或浓度）与检测器的响应值（峰面积或峰高）呈正比,1.标准曲线法：,也称外标法或直接比较法。用标准品等体积直接进样，得标准曲线，再用待测样品的峰面积（或峰高）与其对照,2.内标法：,选择适宜的物质作为欲测组分的内标物加入到样品中，内标物的选择是关键,3.标准加入法：,以欲测组分的纯物质作内标物加入到待测样品中,五、临床应用,氨基酸的分析,蛋白质、酶及多肽,糖类,核酸类,药物及毒物,