菌落总数与大肠菌群数测定--课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,菌落总数与大肠菌群数测定,1,ppt课件,菌落总数与大肠菌群数测定1ppt课件,主要内容,菌落总数测定,大肠菌群测定,MPN,法原理（拓展内容）,2,ppt课件,主要内容菌落总数测定2ppt课件,菌落总数测定,掌握菌落总数测定方法,实验原理,不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，,36,，,48h,（水产品,30,，,72h,），菌落数,3,ppt课件,菌落总数测定掌握菌落总数测定方法3ppt课件,菌落总数测定,器材与试剂：,样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，,1ml,吸管，培养皿,4,ppt课件,菌落总数测定器材与试剂：4ppt课件,菌落总数测定,5,ppt课件,菌落总数测定5ppt课件,倾注培养,6,ppt课件,倾注培养6ppt课件,培养结果,7,ppt课件,培养结果7ppt课件,菌落总数测定,实验步骤,5.,菌落计数：,肉眼观察，可用放大镜，可标记,必要时分区计数，菌落成片者作废,计算方法,某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值,选择菌落数在,30-300,之间的稀释度,（,1,）仅有一个稀释度在此范围：,菌落数,稀释倍数,8,ppt课件,菌落总数测定实验步骤8ppt课件,菌落总数测定,计算方法：,（,2,）有两个稀释度在,30-300,之间,菌落数之比,2,，选较小值,菌落数之比,300,取稀释倍数最大者,（,4,）所有稀释度均,30,取稀释倍数最小者,（,5,）没有任何稀释度在,30-300,之间,选最接近该范围者,结果单位：,CFU/ml,（,g,）,9,ppt课件,菌落总数测定计算方法：9ppt课件,菌落总数测定,注意事项：,1.,无菌操作,2.,标记,3.,何时更换吸管,4.,吸吹混匀,5.,琼脂培养基保温,6.,安全常识,10,ppt课件,菌落总数测定注意事项：10ppt课件,大肠菌群数测定,实验目的,实验原理,36,，,48h,，产气（小倒管）,三步法：初发酵、复发酵,器材与试剂,样品、无菌生理盐水、,LST,肉汤，,BGLB,肉汤,1ml,吸管、,10ml,吸管、试管、小倒管,11,ppt课件,大肠菌群数测定实验目的11ppt课件,初发酵,器材与试剂,样品、,225ml,无菌生理盐水、,9ml,无菌生理盐水、双料,LST,肉汤，单料,LST,肉汤，,10ml,吸管、,1ml,吸管、吸球,12,ppt课件,初发酵器材与试剂12ppt课件,大肠菌群数测定,实验步骤：,1.,初发酵,13,ppt课件,大肠菌群数测定实验步骤：13ppt课件,14,ppt课件,14ppt课件,15,ppt课件,15ppt课件,吸取样品方法,16,ppt课件,吸取样品方法16ppt课件,加注样品,17,ppt课件,加注样品17ppt课件,初发酵结果,右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。,18,ppt课件,初发酵结果右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。18ppt课件,实验步骤,3.,复发酵,（,1,）选取产气试管,（,2,）接种至,10mlBGLB,肉汤中,（,3,）培养：,36,，,48h,（,4,）观察指标：若产气则报告大肠菌群阳性。,19,ppt课件,实验步骤19ppt课件,大肠菌群数测定,实验步骤,2.,分离培养,（,1,）制备伊红美蓝平板：,45,，无菌，倾注，,15ml,（,2,）选产酸产气的发酵管,（,3,）接种至伊红美蓝平板,分区划线法,（,4,）培养：,36,，,48h,20,ppt课件,大肠菌群数测定实验步骤20ppt课件,分离培养,器材与试剂,初发酵结果（,4,只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基,21,ppt课件,分离培养器材与试剂21ppt课件,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,22,ppt课件,分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线,分区划线法,操作要点,1.,划下一个区前必须灭菌接种环,2.,划线时接种环同平板呈,30-40,角,3.,每次划线应该压到上一个区域的,2-3,条线,4.,用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动,23,ppt课件,分区划线法操作要点23ppt课件,大肠菌群数测定,实验步骤,2.,分离培养：,（,5,）菌落特征：,深紫黑色、有金属光泽,紫黑色、无或略有金属光泽,淡紫红色、中心颜色深,（,6,）革兰染色、镜检：选特征菌落,24,ppt课件,大肠菌群数测定实验步骤24ppt课件,革兰染色法,器材与试剂,结晶紫、卢戈碘液、,95%,乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸,25,ppt课件,革兰染色法器材与试剂25ppt课件,革兰染色法,涂片：接种环，挑取菌落，,生理盐水一滴，涂匀,热固定：通过火焰若干次,初染：结晶紫一滴，,1min,，水洗,媒染：卢戈碘液一滴，,1min,，水洗,脱色：,95%,乙醇，,30s,或至无色为止,复染：复红一滴，,30s,26,ppt课件,革兰染色法涂片：接种环，挑取菌落，26ppt课件,涂片,27,ppt课件,涂片27ppt课件,热固定,28,ppt课件,热固定28ppt课件,初染,29,ppt课件,初染29ppt课件,媒染,30,ppt课件,媒染30ppt课件,脱色,31,ppt课件,脱色31ppt课件,复染,32,ppt课件,复染32ppt课件,革兰氏染色阴性,革兰氏染色阳性,革兰染色法,33,ppt课件,革兰氏染色阴性革兰氏染色阳性革兰染色法33ppt课件,复发酵,器材与试剂,培养,24,小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管,34,ppt课件,复发酵器材与试剂34ppt课件,大肠菌群数测定,实验步骤,3.,复发酵,（,1,）选取鉴定为无芽孢,G,-,杆菌的菌落,1-3,个,（,2,）接种至,10ml,乳糖蛋白胨培养液,（,3,）培养：,37,，,24h,（,4,）观察指标：产酸，产气,35,ppt课件,大肠菌群数测定实验步骤35ppt课件,液体接种,36,ppt课件,液体接种36ppt课件,复发酵,复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生,37,ppt课件,复发酵复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生37,大肠菌群数测定,注意事项：,1.,无菌操作,2.,吸管使用,3.,洗去染液的方法,4.,显微镜保养,5.,液体接种,38,ppt课件,大肠菌群数测定注意事项：38ppt课件,MPN,法原理,MPN,法（,Most Probable Number Method,）,目的：对某种细菌进行选择性计数,核心思想：泊松分布,实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算,MPN,值,39,ppt课件,MPN法原理MPN法（Most Probable Numbe,MPN,法原理,MPN,法（,Most Probable Number Method,）,1.,细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布,:P(x=k)=e,-x,x,k,/k!,x:,细菌浓度，,k:,进入发酵管的细菌数,2.,若在,n,管发酵中，令接种水样量为,Vi,，阳性管数为,Pi,，阴性管数为,Qi,，则该检验结果发生的概率为：,其中,C,为常系数,V,为总水样量，,x,为细菌个数,40,ppt课件,MPN法原理MPN法（Most Probable Numbe,MPN,法原理,3.,当,y(x),max,，,XMPN,4.,由于,y(x),为单极值函数，令,dy/dx=0,即,5.,解此方程，得,x=MPN,6.,该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解,7.,日常实验时采用查表法推算,MPN,值。,8.,表格在教材第,260-261,页。,41,ppt课件,MPN法原理3.当y(x)max，XMPN41ppt课件,谢谢！,42,ppt课件,谢谢！42ppt课件,