教育专题：42课题2多聚酶链式反应扩增

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,5 DNA,和蛋白质技术,课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段,生物样品,DNA,片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR,技术诞生所依赖的社会需求和研究需要,脱氧核苷酸结构式,O,O,P,O,HO,碱基,O,OH,O,O,P,O,HO,OH,碱基,5,3,3,5,碱基,脱氧核糖,磷酸基团,碱基,脱氧核糖,碱基,脱氧核糖,5,3,多脱氧核苷酸链结构简图,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,引物酶,引物酶,RNA,引物,RNA,引物,DNA,的复制,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,引物酶,引物酶,RNA,引物,RNA,引物,DNA,的复制,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCT,3,AGCGTAGCTGCGACCTAGC,3,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,如何在体外设置一个类似,DNA,复制环境？,DNA,的复制,加热,变 性,复性,复温,DNA,的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使,DNA,双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链,DNA,这称为,DNA,的变性。,解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称,DNA,复性。,靶序列,靶序列,PCR,循环第一步：加热变性,复性（退火）,模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降到,50,0,C,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,PCR,循环第二步：引物与靶序列退火,延伸,DNA,模板引物结合物在,TaqDNA,聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的,DNA,链,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq,DNA,聚合酶,PCR,循环第三步：引物延伸,靶序列,靶序列,第,1,个,PCR,循环完成后：得到两个拷贝的靶序列,循环次数,DNA,数量,1,2,2,4,3,8,20,1,048,576,30,1,073,741,824,3,、,30,次循环后靶序列扩增的数量,Taq,DNA,聚合酶（,thermus,aquaticus,),酶,活性,(%),温度,(,),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,标准的,PCR,反应体系,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0.1,2ug,Taq,DNA,聚合酶,2.5u,Mg,2+,1.5mmol/L,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,模板,DNA,94,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,94,55,引物,1,引物,2,DNA,引物,变性,复性,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,55,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,延伸,复性,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,94,第,2,轮开始,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,94,55,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,变性,复性,延伸,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,假设,PCR,反应中，只有一个,DNA,的片段作为模板，请计算在,30,次循环后，反应物中大约有多少这样的,DNA,片段,？,动动脑,72,94,55,PCR,循环,循环数,变性,复性,延伸,第一次,94,C,，,5min,30,次,4,，,30s,55,，,30s,72,，,1min,最后一次,4,，,1min,55,，,30s,72,，,1min,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（,）,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温复性,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,二、,PCR,的实验操作,1,、,PCR,仪,（一）设备及用具,实质上一台能够,自动调控温度,的仪器,2,、微量离心管,一种,薄壁塑料管,，总容积为,0.5ml,3,、微量移液器,用于,定量转移,PCR,配方中的,液体，,其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,PCR,仪,微量离心管,微量移液器,1,、准备,2,、移液,（二）实验操作步骤,按照,PCR,反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上,用微量移液器按照,PCR,反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂,过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁,注意：,3,、混合,B,、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀,A,、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢,将离心管放入,PCR,仪上，设置好,PCR,仪的循环程序,过程：将微量离心管放在离心机上,离心约,10s,4,、离心,5,、反应,离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果,PCR,技术,高度灵敏，,为了避免外源,DNA,等因素的污染而造成干扰实验，,PCR,操作时要注意做到：,6,、注意事项,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头,细胞内,DNA,复制和细胞外,PCR,扩增的比较,项目,DNA,复制,PCR,扩增,不,同,点,场所,细胞内,细胞外,能量,ATP,提供能量,不需,ATP,提供能量,酶,解旋酶、,DNA,聚合酶,耐热的,Taq,DNA,聚合酶,是否有转录,伴有转录、产生引物,无转录、需加入两种引物,特点,边解旋边复制，,半保留复制,体外迅速扩增,循环次数,受生物体自身控制,30,多次,缓冲液,不需要,需要人为控制,设备,无,需要严格控制温度,变化的温控设备,相,同,点,原料,四种脱氧核苷酸,复制原理,严格遵循碱基互补配对原则,模板,DNA,为模板,引物,都需要与模板相结合的引物,（一）理论上,DNA,扩增数目的计算,三、,课题成果评价,1,、,一条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,2,n,2,、,a,条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,a x2,n,（二）实验中,DNA,含量的测定,1,、,原理,可以通过计算,DNA,含量来评价扩增的效果，,DNA,在,260nm,的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与,DNA,的含量有关,2,、,过程,稀释,2uLPCR,反应液，加入,98uL,蒸馏水，即将样品进行,50,倍稀释,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长,260nm,处，将紫外分光光度计的读数调节至零,取,DNA,稀释液,100uL,至比色杯中，测定,260nm,处的光吸收值,计算,计算,DNA,含量（,g,）,50 x (260nm,的读数）,x,稀释倍数,50,：,1,g,/ml,的,DNA,在厚度为,1cm,比色杯中的吸光值为,0.02,比色杯,四、课题延伸,例如：,PCR,产物每轮循环增加一倍，,30,轮循环扩增量达,2,30,个拷贝（,10,9,拷贝）,PCR,技术是,80,年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点,