分析化学16色谱分析法概论ppt课件

,仪器分析,第十六章 色谱分析法概论,第十六章 色谱分析法概论,chromatography,色谱法的分类和发展,色谱过程和基本原理,基本类型色谱方法及其分离机制,色谱法基本理论,高分离效能,高灵敏,高选择性,分析速度快,应用范围广,色谱法的特点,:,色谱学的重要作用,诺贝尔化学奖：,1948,年，瑞典,Tiselins,，电泳和吸附分析；,1952,年，英国马丁,(Martin),和辛格,(Synge),，分配色谱。,应用的科学领域：生命科学、材料科学、环境科学等。（科学的科学）,药学（药物分析）：各国药典收载了许多色谱分析方法。中国药典二部，,700,多，纯度检查、定性鉴别或含量测定，一部，,600,多鉴别或含量测定。,第一节 色谱法的分类和发展,一、色谱法的分类,按流动相的分子聚集状态分类,:,GC,、,LC,、,SFC,等。,按固定相的分子聚集状态分类,:,GSC,、,GLC,、,LSC,、,LLC,等。,按操作形式分类,:,柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等。,按色谱过程的分离机制分类,:,分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、毛细管电泳法等。,毛细管电色谱法,（,CEC,）,色谱法,GSC,液相色谱法 （,LC,）,柱色谱法,平面色谱法,毛细管电泳法,（,CE,）,LLC,LSC,SEC,IEC,BPC,纸色谱法,薄层色谱法,（,TLC,）,LLC,LLC,LSC,气相色谱法,（,GC,）,柱色谱法,GLC,超临界流体色谱法,（,SFC,）,二、色谱法的发展,（一）色谱法的历史,（二）色谱法的现状和发展趋势,1,新型固定相和检测器的研制,2,色谱新方法的研究,3,色谱联用技术,4,色谱专家,第二节 色谱过程和基本原理,一、色谱过程,实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相,(stationary phase),和流动相,(mobile phase),。,色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间,多次,“,分配,”,的过程。,色谱过程,组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。,二、色谱流出曲线和有关概念,色谱流出曲线,是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。,基线,是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器,(,主要是检测器,),的噪音随时间的变化。,色谱峰,是流出曲线上的突起部分。,正常色谱峰、拖尾峰和前延峰,对称因子,f,s,(symmetry factor),：,衡量色谱峰的对称性,到,20,页,到,19,页,保留时间,(retention time;,t,R,),：从进样到某组 分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。,死时间,(,t,0,),：分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。,调整保留时间,( ),：某组分由于溶解,（,或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间。,定性参数,1,定性参数,2,保留体积,(,V,R,),：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。,死体积,(,V,0,),：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。,固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔容积的总和。,定性参数,3,调整保留体积,(adjusted retention volume),：由保留体积扣除死体积后的体积,相对保留值,(,r,),：两组分的调整保留值之比,注意：,V,R,是定值，,t,R,与,F,C,成反比,定性参数,4,保留指数,(retention index,；,I,) :,在,GC,中，以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准，用两个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分，这个相对值称为保留指数，又称,Kovats,指数，定义式：,z,与,z+n,为正构烷烃对的碳原子数 ，,Z,为,6,，,7,，,8,，,I,为,600,，,700,，,800,定量参数,峰高,(peak height,；,h,),：组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。,峰面积,(peak area,；,A,),：色谱曲线与基线间包围的面积。,返回,返回,柱效参数,标准差,(standard deviation,；,),：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即,0.607,倍峰高处的峰宽之半。,的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。,越大，组分越分散；反之越集中。,半峰宽,(,W,1/2,),：峰高一半处的峰宽,W,1/2,=2.355,峰宽,(peak width,；,W,),：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。,W,=4,或,W,=1.699,W,1/2,总分离效能指标,分离度,(resolution,；,R,),：又称,分辨率,。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。,分离度,设正常峰，,W,1,W,2,= 4,，,则,R,=1.5,时，,99.7%,面积,(,t,R,3,),被分开，,t,R,=6,，称,6,分离 。,三、分配系数与色谱分离,(,一,),分配系数和容量因子,分配系数,(distribution coefficient,；,K,),是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相,(s),与流动相,(m),中的,浓度,(,C,),之比。,分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（,和压力）,有关。是组分的,特征常数,。,容量因子,(capacity factor,；,k,),：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量,(,m,),之比。（摩尔数？）,又称为质量分配系数或分配比。,分配系数与色谱分离,还与固定相和流动相的体积有关。,容量因子与,分配系数的关系,分配系数与色谱分离,（二）分配系数和容量因子与保留时间的关系,t,R,=,t,0,(1+,k,),t,R,=,t,0,(1+,K,),v,=,L,/,t,R,u,=,L,/,t,0,（三）色谱分离的前提,K,A,K,B,或,k,A,k,B,是色谱分离的前提,。,=,t,0,(1+,K,A,),=,t,0,(1+,K,B,),t,R,=,t,0,(,K,A,K,B,),t,R,0,K,A,K,B,k,A,k,B,分配系数与色谱分离,推导过程：,第三节 基本类型色谱方法及其分离机制,分配色谱法,吸附色谱法,离子交换色谱法,空间排阻色谱法,一、分配色谱法,分配色谱法,分离原理,利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。,溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则,K,越大。在,LLC,中,K,主要与流动相的性质,(,种类与极性,),有关；在,GLC,中,K,与固定相极性和柱温有关。,分配色谱法,固定相,又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。,流动相,气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。 液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。,正相,液液分配,色谱,：流动相的极性弱于固定,相的极性。,反相,液液分配,色谱,：流动相的极性强于固定,相的极性。,分配色谱法,洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。,正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）。,反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。,二、吸附色谱法,分离原理,利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。,吸附过程是试样中组分的分子,(X),与流动相分子,(Y),争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程 。,吸附系数与吸附剂的,活性、组分的性质和,流动相的性质有关。,吸附色谱法,固定相,多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。,硅胶,表面硅醇基为吸附中心。,经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶,高效液相色谱,：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。,气相色谱,：高分子多孔微球等,吸附色谱法,流动相,有机溶剂（硅胶为吸附剂）,洗脱能力,：主要由其极性决定。,强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使,k,值小，保留时间短。,Snyder,溶剂强度,o,：吸附自由能，表示洗脱能力。,o,值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。,表,16-1,一些溶剂在硅胶上的,o,值,溶剂,溶剂强度,（,o,）,溶剂,溶剂强度,（,o,）,正戊烷,0.00,甲基特丁基醚,0.48,正己烷,0.00,醋酸乙酯,0.48,氯仿,0.26,乙腈,0.52,二氯甲烷,0.40,异丙醇,0.60,乙醚,0.43,甲醇,0.70,洗脱顺序,k,a,=,K,a,S,a,/,V,m,在色谱柱（,S,a,与,V,m,一定）时，,K,a,大的组分保留强，后被洗脱，,K,a,小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。,K,a,与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。,吸附色谱法,以,硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。,饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强,(,但要考虑其他因素的影响,),。,不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。,分子中取代基的空间排列,分离原理 利用被分离组分离子交换能力的,差别而实现分离。,分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。,阳离子交换：,阴离子交换：,离子交换通式：,3,3,+,+,RNR,+,OH,-,Cl,RNR,+,Cl,OH,交换,再生,交换,再生,+,3,+,+,RSO,H,+,Na,+,Na,+,3,H,RSO,三、离子交换色谱法,离子交换色谱法,交换反应的平衡常数即,选择性系数,：,K,A/B,是离子对树脂亲和能力相对大小的度量，,K,A/B,越大，,A,的交换能力大，越易保留。,常选择某种离子（如,H,+,或,Cl,）作参考。,K,A,、,K,B,为,A,、,B,的分配系数。,离子交换色谱法,固定相,离子交换剂,(ion exchanger),：离子交换树脂（,resin,）和硅胶化学键合离子交换剂。,离子交换树脂,:,有网状骨架及可离解、可交换基团，如磺酸基,(,SO,3,H),、羧基,(,COOH),及季胺基,(,NR,3,+,OH,),等。性能指标常用交联度、交换容量和粒度等。,化学键合离子交换剂,：键合在薄壳型和全多孔微粒硅胶上。用于,HPLC,中的固定相,离子交换色谱法,流动相,一定,pH,和离子强度的缓冲溶液，有时也加入少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以提高选择性。,离子交换色谱法,影响保留行为的因素被分离离子、离子交换剂、流动相的性质等,(1),离子的电荷和水合半径：价态高选择性系数大。同价阳离子在酸性阳离子交换剂上,水合离子半径,选择性系数小。,稀溶液中阳离子在强酸性阳离子交换树脂上的交换顺序是：,Fe,3+,Al,3+,Ba,2+,Pb,2+,Sr,2+,Ca,2+,Ni,2+,Cd,2+,Cu,2+,Co,2+,Mg,2+,Zn,2+,Mn,2+,Ag,+,Cs,+,Rb,+,K,+,NH,4,+,Na,+,H,+,Li,+,离子交换色谱法,常见阴离子在强碱性阴离子交换树脂上的交换顺序通常为,：,柠檬酸根,PO,4,3,SO,4,2,I, ,SCN, ,Cl, ,CH,3,COO,OH,F,保留顺序？洗脱顺序？,离子交换色谱法,(2),离子交换剂的交联度和交换容量,:,在一定的范围内树脂的交联度越大，交换容量越大，则组分的保留时间越长。,(3),流动相的组成：交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。流动相的离子强度高，使组分的保留值降低。,流动相的,pH,：溶质的离解受到抑制则保留时间变短。弱离子交换树脂的交换容量在某一,pH,值有极大值。,四、空间排阻色谱法,分离原理,根据被分离组分分子的线团尺寸进行分离。,也称为分子排阻色谱法。,空间排阻色谱法,根据空间排阻（,steric exclusion,）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：,渗透系数,：,K,p,=,X,s,/,X,m,（,0,K,p,1,）,由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，,K,p,与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。,空间排阻色谱法,固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质,主要性能参数,平均孔径,排斥极限（,K,p,=0,）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量,分子量范围：排斥极限（,K,p,=0,）与全渗透点（,K,p,=1,）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。,空间排阻色谱法,流动相,要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低,水溶性试样选择水溶液为流动相,(,称为,凝胶过滤色谱,gel filtration chromatography,；,GFC,),；,非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相,(,凝胶渗透色谱,gel permeation chromatography,；,GPC,),。,空间排阻色谱法,保留体积与渗透系数的关系,V,m,V,0,分子线团尺寸（分子量）大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱,。,小结,色谱过程方程式,：,分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。,K,在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数,K,、吸附系数,K,a,、选择性系数,K,A/B,和渗透系数,K,p,，,V,s,分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。,小结,第四节 色谱法基本理论,要使,R,大，必须：,1,、,t,R,大,- k,大,-,热力学,2,、,W,小,-,峰展宽小,-,动力学,色谱理论包括两方面,:,热力学理论,：研究分配,(,分离,),过程，塔板理论（,plate theory,）。,动力学理论,：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（,rate theory,）。,一、塔板理论,始于马丁（,Martin,）和辛格（,Synge,）提出的塔板模型。,分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。,色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。,塔板理论假定：,在色谱柱内每一,“,塔板,”,H,内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。,流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。,分配系数在各塔板内是常数。,纵向扩散可以忽略。,（一）质量分配和转移,1,、,单一组分,B,（,k,B,=0.5,）的分配和转移,设色谱柱的塔板数,n,=5,，即,r,=0,、,1,、,2,、,3,、,4,（或,n,-1,）号。,将单位质量的,B,加到第,0,号塔板上。,分配平衡后，,0,号塔板内,m,s,/,m,m,0.333/0.667,。,进入一个塔板体积的流动相（一次转移），,经过,N,次转移后，质量分布符合二项式,(,m,s,+,m,m,),N,的展开式。,如,N,=3,，展开式为：,(0.333+0.667),3,=0.037+0.222+0.444+0.296,0 1 2 3,号,在固定相和流动相中的质量分布由,k,(,K,),决定,转移,N,次后，第,r,号塔板中的质量,N,m,r,：,例：转移,3,次后，在第,2,号塔板内,的溶质分数,组分,B(,k,B,=0.5),在,n,=5,的色谱柱内及出口的分布,N r 0 1 2 3 4,柱出口,0 1 0 0 0 0 0,1 0.333 0.667 0 0 0 0,2 0.111 0.444 0.445 0 0 0,3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0,4 0.012 0.099 0.269 0.395,0.198,0,5 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329,0.132,6 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329,0.219,7 0 0.006 0.038 0.128 0.256,0.219,8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170,9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114,10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.068,注意：,1,、柱出口处的质量分数的计算。,2,、质量（浓度）最大点的,N,，,即保留体积。,2,、两组分的分离,A(,k,A,=1),和,B(,k,B,=0.5),两组分,组分,A(,k,A,=1),在,n,=5,的色谱柱内和出口的分布,N r 0 1 2 3 4,柱出口,0 1 0 0 0 0 0,1 0.5 0.5 0 0 0 0,2 0.25 0.5 0.25 0 0 0,3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0,4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0,5 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157,0.032,6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079,7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118,8,0.004 0.032 0.111 0.220 0.274,0.137,9,0.002 0.018 0.072 0.166 0.247,0.137,10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124,结果：,组分,B,:,k,=0.5,当,N,=6,和,7,时，柱出口产生,B,的浓度最大点。,组分,A,：,k,=1,，,N,=8,和,9,时，柱出口处达到浓度最大点。,两组分开始分离，,k,小的组分,B,在柱后先出现浓度极大值,即先出柱。,一根色谱柱,n,=10,3,以上，,组分有微小的分配系数,(,容量因子,),差别即可实现完全分离。,分配系数,(,容量因子,),不等是分离的前提。,(,二,),流出曲线方程,1.,二项式分布曲线,以组分,A,在柱出口处的质量分数对,N,作图。,N,柱出口,0 0 1 0 2 0 3 0 4 0,5 0.032,6 0.079 7 0.118,8 0.137 9 0.137,10 0.124,k,=1,的组分从,n,=5,色谱柱中的流出曲线图,2.,色谱流出曲线,当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。,3,、色谱流出曲线方程（正态分布方程）,描述组分流出色谱柱的浓度变化：,为标准差，,t,R,为保留时间，,C,为任意时间,t,时的浓度，,C,0,为峰面积,A,，即相当于某组分的总量。,t,=,t,R,时，,C,有极大值：,C,max,即流出曲线的峰高,h,。,一定时， 峰高,h,取决于,C,0,。,C,0,一定时， 峰高,h,取决于,。,流出曲线方程的常用形式：,不论,t,t,R,或,t,t,R,时，浓度,C,恒小于,C,max,。,C,随时间,t,向峰两侧对称下降。,越小，峰越锐。,是柱效的标志。,色谱峰面积,以,A,代替,C,0,，,h,代替,C,max,，且,W,1/2,=2.355,，,峰面积,:,A = h(2,),1/2,A=1.065W,1/2,h,色谱定量的参数,(,三,),理论塔板高度和理论塔板数,(height equivalent to atheoretical plate,或,plate height,H,),(plate number,n,),是色谱柱效参数。,理论塔板数与标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间的关系：,理论塔板高度,H,=,L,/,n,注意：,1.,计算,n,时使标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间,单位一致,2.,n,的单位,例,在柱长,2m,、,5%,阿皮松柱、柱温,100,、记录纸速为,2.0cm/min,的实验条件下，测定苯的保留时间为,1.50min,，半峰宽为,0.10cm,。求该柱的理论塔板高度和每米的理论塔板数。,每米理论塔板数为：,2.410,3,/2=1.210,3,(m,1,),解：,有效理论塔板数和有效理论塔板高度,H,ef,=,L,/,n,ef,塔板高度的统计概念：,单位柱长引起的分子的离散度,H,=,2,/,L ,2,HL,是组分分子在色谱柱内离散的度量,2,是总的离散程度，即单位柱长内分子离散的累积,小结,塔板理论解释了流出曲线的形状,说明了组分的分配和分离过程,提出了评价柱效的指标,但某些假设与实际色谱过程不符,二、速率理论,塔板理论的不足：,组分在两相中不可能真正达到分配平衡；,组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略,;,没有考虑各种动力学因素对传质过程的影响；,无法解释柱效与流动相流速的关系；,不能说明影响柱效有哪些主要因素。,速率理论,1956,年，荷兰学者范第姆特,(Van Deemter),提出了色谱过程动力学理论,速率理论。,塔板高度,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,H,=,A,+,B,/,u,+,Cu,涡流扩散,(eddy diffusion),也称为多径扩散,速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,涡流扩散,原因：柱填充不均匀,A,=2,d,p,速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,A,：涡流扩散系数，其单位为,cm,。,：填充不规则因子，,填充技术和填料颗粒形状决定。,d,p,：填料,(,固定相,),颗粒的平均直径，,d,p,小，,A,小；但,d,p,太小，,和柱阻,大。,纵向扩,(longitudinal diffusion),速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,组分向,“,塞子,”,前后扩散，使区带展宽。,原因：浓度差,纵向扩散项,B,/,u,影响因素：,u,，,B,=2,D,m,B,：纵向扩散系数，其单位为,cm,2,/s。,：弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散的阻碍。,D,m,：组分在,流动相,中的扩散系数。,速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,传质阻抗,(mass transfer resistance),速率理论,(,一,),影响,H,的动力学因数,传质：溶解、扩散、转移的过程。,传质阻抗：影响传质过程的阻力。,结果,：（,非平衡状态,），使有些分子较快向前移动，而另一些滞后，引起峰展宽。,传质阻抗系数,C,，其单位,s,，包括,C,m,、,C,s,。,速率理论,速率理论（二）流动相线速度对塔板高度的影响,A,：不受,u,影响,B/u,：,u,H,Cu,：,（,C,m,、,C,s,）,u,H,速率理论（二）流动相线速度对塔板高度的影响,总结果：,u,较低时：,B/u,主导，,u,H,u,较高时：,Cu,主导，,u,H,u,最佳,主要内容：,色谱过程和分离原理,基本概念和计算公式：保留值、分配系数、容量因子、,n,、,H,、,R,色谱基本理论：塔板理论、速率理论,基本类型色谱机制,