单克隆抗体技术

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单克隆抗体制备技术,广州医学院检验系,徐霞,基本概念,抗原决定镞（抗原表位）,细胞克隆,多克隆抗体,单克隆抗体,Antigenic determinant,是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(,epitope,).,细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团,Polyclonal,antibody,PcAb,：,针对多种抗原决定簇的混合抗体,Monoclonal antibody,McAb,:,由单个,B,细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体,杂交瘤技术的理论基础,淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体,细胞融合,技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性,利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备,McAb,当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（,hybrid cell）。,细胞,DNA,合成途经,1.替代途径：次黄嘌呤（,H）,HGPRT,2.主要途径：,氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸,谷 氨 酰 胺 （,A-）,尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸,TK,3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（,T）,HAT,选择培养基的原理,HAT,选择培养基组分,次黄嘌呤（,hypoxanthine,H),氨甲喋呤（,aminopterin,A):,叶酸拮抗剂,胸腺嘧啶核苷（,thymidine,T),抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （,B,细胞）（,B,细胞恶性肿瘤）1.抗体分泌（,Ig,+)1.,具永生性 2.,HGPRT+,在,HAT,生长 2.8-,AG,筛选出,HGPRT-,株,PEG,融合,HAT,筛选 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（,HGPRT+、,Ig,+）,融合的结果及命运,杂交瘤细胞,未融合的脾细胞,未融合的骨髓瘤细胞,脾-脾杂交细胞,骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞,免疫动物 培养骨髓瘤细胞,收集致敏的,B,淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT,选择培养基筛选杂交瘤细胞,检测筛选阳性细胞,克隆化培养（反复3-5次）,获得稳定分泌,McAb,的杂交瘤细胞株,McAb,的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）,McAb,纯化及鉴定,制备单克隆抗体的基本技术,1,抗原提纯与动物免疫,2,骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备,3,细胞融合,4,抗体检测,5,杂交瘤的克隆化和冻存,6,McAB,的制备,7,单克隆抗体的纯化,免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性,B,细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。,可溶性抗原10-15,ug,/100ul+,等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）,选用6-12周龄,Balb,/c,小鼠,颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果,可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。,骨髓瘤细胞系选择要点：,稳定易培养、自身不分泌,Ig,、,融合率高、,HGPRT,缺陷株,常用骨髓瘤细胞系有：,NS1、SP20、X63,等。,保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）,防止支原体污染（胎牛血清）,融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95,融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞,饲养细胞一般在融合前一天制备,免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中,B,淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。,融合比例：,骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10,融合剂：40,%,PEG（,分子量1000-2000）,融合24小时后加,HAT,培养液 2周后 改用,HT,培养液 2周后 改用一般培养液,一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。,可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。,克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次,克隆化方法：,有限稀释法,、软琼脂平板法、显微克隆法,阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染,单抗生产的方法：,动物体内诱生法,：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。,单抗纯化方法：,盐析,凝胶过滤,离子交换层析,亲和层析法,辛酸沉淀法,用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。,血清,50%饱和度硫酸胺,上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）,33%饱和度硫酸胺,上清 沉淀,拟球蛋白,r,球蛋白,凝胶过滤法,干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。,交联葡聚糖凝胶(,Sephadex,),琼脂糖凝胶(,Sepharose,),离子交换层析法,DEAE,纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂,CM,纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂,亲和层析法,将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。,A,蛋白-,Sepharose,CL 4B,单克隆抗体特性,理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备,单克隆抗体在医学中的应用,检验医学诊断试剂,（1）病原微生物抗原抗体的检测,（2）肿瘤抗原的检测,（3）免疫细胞及其亚群的检测,（4）激素测定,（5）细胞因子的测定,蛋白质的提纯,肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术,基因工程抗体与抗体库技术,单抗体内应用和疗效受限原因：,1.,鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性,2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少,3.生产成本高,难于普及应用,人杂交瘤技术未获真正突破原因:,融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫,基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。,抗体库技术：用细菌克隆取代,B,细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。,临床上欲开展急性心肌损伤特异性标志物人心肌肌钙蛋白,I（,cTnI,）,的检测项目，现提供给你重组,cTnI,抗原，请你设计可行性实验方案。,