核酸的提取分离

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,生化工艺学课件,第五章 核酸的提取分离,第五章 核酸的提取分离,5.1,概述,5.2,核酸的理化性质,5.3,核酸的作用与用途,5.4,动物脏器核酸的提取分离方法,5.5,转移因子的制备,5.6,辅酶,A,的提取,5.7,复合辅酶的提取,5.8,从啤酒酵母中提取,RNA,5.1,概述,核 酸（,nucleic acid),核苷酸,(nucleotide),磷酸,(phosphoric acid),核苷,(nucleoside),戊糖,(pentose),碱基,(base),组成核苷酸的碱基,Fig.2-4,The primary structure of DNA.,脱氧核糖核酸（,DNA,）主要存在于细胞核的染色体中，核糖核酸（,RNA,）主要存在于细胞的微粒体中，各种生物体含有核酸的多少不同,应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多,我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸，,76,个核苷酸，与天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构，有接受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力,呈味,核苷酸,是目前国际上流行的新型鲜味剂，其学名为,5,IMP,（肌苷酸钠）、,5,GMP,（鸟苷酸钠）、,I,G,（,50,IMP,50,GMP,），我国第三代鲜味剂鸡精的特点为：由鸡肉、鸡蛋、呈味,核苷酸,、水解蛋白粉、味精及多种,调味,料复合而成。,核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物,保健品：某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能力，还能改善微循环、改善脑机能；促进新陈代谢、抗疲劳；提高免疫力；活化皮肤细胞、润肤美容。,核酸在食品和药品领域中的应用,？,核酸工业的市场分析,核酸药物产品的开发已有近,70,年历史。目前，日本是核酸产品的最大生产国，其年产量约,7500,吨，约占世界产量的,90%,；西方国家中，意大利也有核酸产品，但产量不是很大。近年来，韩国核酸产业兴起，主要为调味品。,我国核酸产品的研究开发起步较早，并取得了令人瞩目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口，仅,ATP,一项每年就从日本进口金额达八千万美元,5.2,核酸的理化性质,5.2.1,核酸的一般性质,1,、,DNA,分子与蛋白质分子、,RNA,相对分子质量？,2,、,DNA,白色纤维状固体，,RNA,白色粉末，均微溶于水，稀碱溶液中成盐后易溶于水，不溶于有机溶剂，但可溶于乙醇的水溶液，,乙醇,50,（,w/w,）时，,DNA,析出，,当,75,时，,RNA,也沉淀出来,溶解度差别分离,10,6,几千到百万 几万到几百万,盐溶液中溶解度差异,提取,RNA,时,NaCl,盐溶液浓度仅为,0.14mol/L,即可,而提取,DNA,时，需先用,0.14mol/L NaCl,将,RNA,除掉，再继续增加,NaCl,浓度至,1mol/L,时才能够将,DNA,提取出来,5.2.1,核酸的一般性质,3,、,DNA,极稀的溶液黏度极大，变性时黏度降低，,pH,超出,5.6-10.9,时，相对黏度突然降低,4,、,可被,酸、碱或酶水解,成各种组分，用层析、电泳等方法分离，主要利用：,RNA,的磷酸酯键对碱敏感：,室温，,0.31mol/L KOH,，,24h,，可将,RNA,完全水解，得到,2-,或,3-,核苷酸的混合物。,DNA,抗碱水解,生理意义,：,DNA,更稳定，遗传信息。,RNA,是,DNA,的信使，完成任务后迅速降解。,5.2.2,核酸的紫外吸收性质,嘌呤、嘧啶环共轭双键紫外吸收，核酸,max,260nm,附近，而,min,230nm,1,、鉴定纯度,纯,DNA,的,A,260,/A,280,1.8,；,纯,RNA,的,A,260,/A,280,2.0,若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则,A,260,/A,280,2,、含量计算，,吸光值为,1.00,时，相当于：,50ug/mL,双螺旋,DNA,或：,40ug/mL,单链,DNA,（或,RNA,）,或：,20ug/mL,寡核苷酸,DNA,和,RNA,均在紫外光下有最高吸收峰，可采用,OD260nm,测定其浓度,另一方面,DNA,和,RNA,含磷含糖，所以可通过糖含量及磷含量的测定方法间接表征核酸的含量,RNA,所含糖为核糖苔黑酚法测定；,DNA,所含糖为脱氧核糖二苯胺法测定。,含磷量测定时均需先经过消化将有机磷转变为无机磷才能测定，纯,RNA,含磷量为,9,，而纯,DNA,含磷量为,9.2%,。,5.2.3,核酸的变性和复性,高温（热变性）、酸碱（,pH,小于,4,或大于,11,）及某些变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。,变性后的理化性质,DNA,的变性是爆发式,的，变性,作用发生在一个很窄的温度范围内。,粘度降低，浮力密度升高。,二级结构改变，部分失活。,260nm,吸收值升高。,增色效应与减色效应,增色效应：在,DNA,的变性过程中，摩尔吸光系数增大,减色效应：在,DNA,的复性过程中，摩尔吸光系数减小。,熔解温度（,T,m,）：,DNA,的双螺旋结构失去一半时对应的温度。,浓度,50ug/mL,时，双链,DNA A,260,=1.00,；,完全变性（单链）,A,260,=1.37,当,A,260,增加到最大增大值一半时，即,1.185,时，对应的温度即为,T,m,。,DNA,的,T,m,一般在,8295,之间,影响,DNA,的,T,m,值的因素,1,、,DNA,均一性 ：,均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析,DNA,的均一性。,2,、,G-C,含量,与,T,m,值成正比（,why,？,）：测定,T,m,，可推知,G-C,含量。,G-C%=,（,T,m,-69.3,）,2.44,3,、介质中离子强度：,离子强度高，,T,m,高，范围变宽。,G-C,对中含有,3,个氢键，较,A-T,对中仅有,2,个氢键更为稳定,5.2.4,核酸的测定,1,、紫外分光光度法,2,、定糖法：,DNA,、,RNA,经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛基化合物，或水解得到,核糖和脱氧核糖,能与某些酚类、苯胺类化合物结合成有色物质（简便，定性,or,颜色深浅定量）,RNA,浓盐酸苔黑酚（,3,，,5-,二羟甲苯）共热绿色,DNA,浓醋酸少量浓硫酸二苯胺共热蓝色,3,、定磷法：,DNA,含磷量,9.2%,，,RNA,含磷量,9,1g,磷相当于,11g,核酸，消化后用钼酸胺定磷试剂,仅测得与嘌呤连接的糖,4,、核酸分析时样品的预处理,用定磷、定糖或紫外吸收的方法测定某一生物材料中核酸或其水解物含量时，需先经预处理去掉杂质，避免干扰,1,）,将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆稀三氯乙酸,or1,高氯酸低温抽提几次，得到,沉淀为蛋白质、核酸、脂类、多糖,等,2,）,用有机溶剂抽提,去除脂溶性磷脂,等物质不溶于,酸的非脂化合物如,DNA,、,RNA,、蛋白质、磷蛋白和少量磷化合物,再采用,酸,（,5,三氯乙酸或,6,高氯酸，,90,o,C,，,15min,，再定糖法测定）或,碱处理法,（,37,o,C,，,0.3-1mol/L,NaOH,，,18h,，,DNA,，,RNA,能够分开）,5.3,核酸的作用与用途,核酸作用：,与生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有密切关系，又是蛋白质合成不可缺少的物质诸多恶性肿瘤、遗传性疾病及放射病均与核酸改变有关,1,、嘌呤和嘧啶类生化产品：,核酸组成中的碱基嘌呤化合物和嘧啶化合物都有良好的抗肿瘤作用，阻断蛋白质、核酸的生物合成，抑制癌细胞的增殖，如：,5-,氟尿嘧啶,2,、核苷类生化产品：,如辅酶,A,3,、核苷酸类生化产品：,如免疫核糖核酸,iRNA,、转移因子,5.4,动物脏器核酸的提取分离方法,核酸及其衍生物类药物，,属天然大分子，结构复杂采用生物材料为原料的,提取法,制造,核苷酸类及其衍生物，,小分子，结构简单,化学合成法,一、,RNA,的提取分离,动物组织捣碎匀浆,0.14mol/L NaCl,溶液提取调,pH,至,4.5,，,RNA.,蛋白，,RNA,与蛋白质分开的方法：,1,）乙醇沉淀法,2,）盐酸胍和去污剂分离法,3,）酚法,二、,DNA,的提取分离,利用核糖核蛋白在,0.14mol/L,NaCl,可溶,，而,DNA,核蛋白则可溶于水或高浓度的盐溶液（,1mol/L,NaCl,）,组织捣碎,0.14mol/L,NaCl,反复洗涤以去除,RNA,（或,0.1mol/L,NaCl,0.05mol/L,NaCl,枸橼酸钠）去污剂,SDS,使蛋白质变性,沉淀用,1mol/L,NaCl,溶解,乙醇沉淀去污剂精制，反复多次,常用去蛋白方法：含有新醇或异戊醇的氯仿沉淀核蛋白离心；,SDS,；苯酚处理，离心分层,提取核酸时要注意保持其完整性（防过酸、碱、低温）,5.5,转移因子的制备,Transfer factor,（,TF,）,一种多核苷酸和多肽小分子物质，为细胞免疫促进剂。可将供体的细胞免疫性转移给受体正常的淋巴细胞，并能促进释放干扰素。临床用于免疫缺陷的病人，如感染、疱疹、乙肝、麻疹等。对恶性肿瘤可作为辅助治疗剂；作用无种属特异性,。,制备,TF,的原料,除特异性供体白细胞外，一般采用正常人血液、脾和扁桃体等原料,提取工艺中,主要采用透析、柱层析、超滤及加絮凝剂和助滤剂再过滤等,5.6,辅酶,A,的提取,辅酶,A,（,Coenzyme A,，,CoA,）,，是由等分子的泛酸、腺嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸构成，,ADP,的衍生物或类似物，相对分子量为,767.54,主要起传递酰基的作用,，来回接受和放出酰基，携带酰基的部位在,SH,上以,HSCoA,表示,对糖、脂类和蛋白质的代谢具有非常重要的影响，,作为白细胞减少症、原发性血小板减少性紫癜、功能性低热、脂肪肝、各种肝炎、冠状动脉硬化、心急梗塞等疾病的重要辅助药物,5.6,辅酶,A,的提取,分离过程：,预处理提取除蛋白,CMA,树脂纯化,LD-601,大孔吸附剂二次纯化浓缩、沉淀、干燥,工艺过程中,CoA,的定性跟踪方法：,硝基盐巯基显色法（,CoA,分子上的巯基能与亚硝基铁氰化物产生不稳定的强烈红色）,定量检测方法：,磺胺乙酰化法和磷酸转乙酰化酶（,PTA,）紫外分光光度法,一般工艺制得的,CoA,制剂，,有氧化型和还原型两种成分,，磺胺乙酰化法测得的是制剂中,CoA,的总效价,5.8,从啤酒酵母中提取,RNA,工业制取,RNA,主要从啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、白地霉和青霉菌等,以上菌株中的核酸大部分是,RNA,，而,DNA,的量很少，只要将菌体分离后经,RNA,抽提后即可废弃酵母泥提取核酸（即可增加经济效益，又可解决饲料酵母存在高核问题）,常用工业方法：,稀碱法、浓盐法和自溶法，氨法破壁,RNA,从细胞中释放，在进行提取、沉淀和纯化,啤酒酵母中,RNA,的提取工艺,破胞（,1,倍体积的,1,稀碱、,8,10,的浓盐或,1,的氨水）离心分离得上清调等电点,2,2.5,离心分离取沉淀脱水干燥,基于被淘汰的,啤酒酵母菌龄较老，蛋白含量高而核酸含量较低,常用得的一次沉淀技术难以获得高纯度的优质核酸先调,蛋白质等电点（,pH4.2,）,除杂蛋白，再调至,核酸等电点,2,左右,RNA,含量测定：,紫外分光光度法、定磷法,