实验二大肠菌群的检验新版课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二大肠菌群的检验,实验二大肠菌群的检验,大肠杆菌的定义,大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。,大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、,IMViC,试验（靛基质、,MR,、,V-P,、柠檬酸盐试验）为,+-,或,-+-,的细菌。,与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（,ETEC,）、致病性大肠杆菌（,EPEC,）、出血性大肠杆菌（,EHEC,）、侵袭性大肠杆菌（,EIEC,）、黏附性大肠杆菌（,EAEC,）。,大肠杆菌的定义大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，,大肠菌群和大肠杆菌的关系,耐热大肠菌群的定义：,能在液体乳糖培养基中,35/37,培养,48h,产酸产气，并在,44.5,培养,24h,产酸产气的细菌（依据,ISO,标准）,大肠菌群和大肠杆菌的关系耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养,卫生学意义,大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。,食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。,大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行,HACCP,管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和,HACCP,实施效果的评估指标。,卫生学意义大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食,大肠杆菌的生物学特性,基本形态：,此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约,50%,的菌株有周生鞭毛，但多数只有,1-4,根，一般不超过,10,根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。,大肠杆菌的生物学特性基本形态：,大肠杆菌的生物学特性,培养特性：,大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为,37,，在,42-44,条件下仍能生长，生长温度范围,15-46,。,在普通营养琼脂上有,3,种菌落形态：,1,）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、,光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；,2,）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易,在生理盐水中自凝；,3,）黏液型：常为含有荚膜的菌株。,大肠杆菌的生物学特性培养特性：在普通营养琼脂上有3种菌落,大肠菌群及大肠杆菌测定,MPN,法检验流程（,FDA BAM,）,检样,50g+450ml,稀释液,适当十倍稀释样品,选择,3,个适宜的连续稀释度的样品稀释液，,每个稀释度接种三管,LST,肉汤（每管,9ml,LST,肉汤并加有导管），,每管接种,1mL,35,，,24 2h 48 2h,没有产气管 有产气管,报告阴性,接种,BGLB,肉汤管 接种,EC,肉汤,35 ,，,48 2h 44.50.5,（水浴培养）,24 2h,48 2h,查,MPN,表报告结果,产气管接种,EMB,平板（,35,、,1824h,）,（大肠菌群）,从,EMB,平板上挑取,5,个可疑菌转接到,PCA,斜,面，进行革兰氏染色、,IMVC,生化鉴定、接,种,LST,复检产气,查,MPN,表报告结果,（大肠杆菌）,大肠菌群及大肠杆菌测定,将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置（361）0C温箱内，培养18h24h，然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。,其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。,9、玻璃珠：直径约5mm,121 高压灭菌15 min。,9、玻璃珠：直径约5mm,选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，,而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。,与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。,2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤,大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。,但某些沙门氏菌、志贺氏菌可被抑制。,在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（361）0C的温箱内培养（242）h，观察产气情况。,蛋白胨提供细菌生长发育所需的氮源、维生素和氨基酸，乳糖提供发酵所需的碳源，磷酸氢二钾维持缓冲体系，伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌的生长。,产气肠杆菌 ATCC 13048 好 粉红，无光泽,金黄色葡萄球菌基本上不生长。,而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。,4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸馏水1000ml（将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH值至7.,而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。,大肠杆菌测定生化鉴定,大肠菌群测定,MPN,法检验几点说明,MPN,检索表：,MPN,为最大可能数,(Most Probable Number),的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。,MPN,检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加,10,倍。,初发酵和证实试验：,1,）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即,“,在,37,分解乳糖产酸产气,”,。,LST,中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许,“,缓慢乳糖发酵（,Slow lactose fermentations,）,”,来促进菌体产气。,BGLB,中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。,2,）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。,产气量与倒管：,在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。,将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置,大肠杆菌测定,EMB,选择性分离鉴别,EMB,平板典型大肠杆,菌菌落特征：,中心黑色或紫红色，有,或无绿色金属光泽,大肠杆菌测定EMB选择性分离鉴别EMB平板典型大肠杆,大肠杆菌测定,EMB,选择性分离鉴别,EMB,是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；,高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；,大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；,该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。,菌名,菌落形态,大肠埃希氏菌,紫黑色，有绿色金属光泽,肺炎克雷伯氏菌,粉色，中心色深,阴沟肠杆菌,粉色，中心色深,弗氏志贺氏菌,无色,鼠伤寒沙门氏菌,无色,粪链球菌,无色,大肠杆菌测定EMB选择性分离鉴别EMB是一种弱选择性培养,革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。,紫黑色，有绿色金属光泽,而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。,3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。,大肠杆菌测定生化鉴定,双料乳糖胆盐发酵培养基除蒸馏水外，其它成分加倍。,没有产气管 有产气管,伊红、美蓝不能结合，故沙门氏菌和志贺氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。,EMB琼脂：1瓶 150ml 250ml三角瓶（每 组配一瓶）,4,再加入伊红,美蓝水溶液,高压灭菌115、15分钟。,5、1ml移液管 5 支,0mL最终pH7.,3个大肠菌群/1L饮水,大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。,10，100,1000 倍稀释（-1，-2，-3）,奇异变形杆菌 ATCC 25933 好，极好 无色,9、玻璃珠：直径约5mm,检样50g+450ml稀释液,金黄色葡萄球菌基本上不生长。,如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。,美蓝又称亚甲蓝，为碱性染料。,4,再加入伊红,美蓝水溶液,高压灭菌115、15分钟。,大肠杆菌测定,革兰氏染色,基本原理：,革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。,1884,年由丹麦医师,Gram,创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两大类。,革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。,革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。大肠杆,大肠杆菌测定,革兰氏染色,基本步骤：,将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染,1min,，水洗；,滴加革兰氏碘液，作用,1min,，水洗；,滴加,95%,乙醇脱色约,15,30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；,滴加番红复染液，复染,1min,，水洗、待干、镜检。,结果：革兰氏阳性菌呈,紫色,，革兰氏阴性菌呈,红色,。,大肠杆菌测定革兰氏染色基本步骤：,大肠杆菌测定,生化鉴定,Test,positive,negative,biotype1,biotype2,reagent,Indole,红色环,不变色,+,-,Kovacs,MR,红色,不变色,+,+,甲基红,V-P,玫瑰红色环,不变色,-,-,V-P,甲、乙液,Citrate,生长,不生长,-,-,-,大肠杆菌测定生化鉴定Testpositivenegati,实验二,大肠菌群的检验,一、实验目的,1,、学习食品中大肠菌群检测程序、方法；,2,、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。,二、实验材料,1,、设备和材料,温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针,2,、培养基及试剂,乳糖,胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（,EMB,）、革兰氏染色液,实验二大肠菌群的检验,GB4789.3-2010,大肠菌群计数,GB4789.3-2010 大肠菌群计数,GB4789.3-2010,大肠菌群计数,GB4789.3-2010 大肠菌群计数,实验二大肠菌群的检验新版课件,（一）最先准备的器材,规格名称 数量 用途,1,、,5