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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,微观技术,马玉堃,生命科学学院,2007,年,3,月,绪论,显微镜在生物学中的应用,显微镜发明,300,多年来，通过不断地改进，它的装置和性能都得到不断改善，并且出现了适应于不同需要的各种特殊显微镜。如能观察活细胞的相差显微镜；既能作形态观察，又能作定性分析的荧光显微镜；作为定量研究的干涉显微镜；用于双折射研究的偏光显微镜；根据量子力学中的隧道效应设计而成，迅速提高生物大分子、超导材料及表面科学等领域研究水平的扫描隧道显微镜；,20,世纪,80,年代发展起来的新一代科技产品，现代形态学、细胞分子生物学、遗传学、神经科学、药理学、材料学及地质学等领域中强有力的研究工具之一,激光扫描共聚焦显微镜等等。光学显微镜技术虽然是经典的技术，然而它还在不断发展之中，所以迄今仍是研究生物学和其他科学的重要手段。,光学显微镜分辨率由于受照明光线波长的限制，理论上其最小分辨距离为,0.2um,，实际上能清晰看到的最小物体直径约为,0.5 um,大小。而电子束的波长很短，电子显微镜最小分辨距离可达到,0.1nm(1A),，相当于原子的大小。所以，自从,1933,年世界上第一架电子显微镜问世之后，大大促进了生物的微观世界研究水平的提高。除了透射电镜之外，还发展了扫描电镜、高压电镜以及很多的衍生技术，如负染技术、胶体金免疫标记技术、大分子,(,核酸,),电镜技术、复型和冷冻蚀刻技术、电镜放射自显影技术及电镜酶细胞化学技术等。这就推进了对细胞超微结构和分子结构的研究。,尼康,E-600,显微镜,尼康,E800,荧光,DIC,显微镜,激光共聚焦扫描显微镜,莱卡倒置显微镜,JEM-1011,透射电子显微镜,莱卡超薄切片机,JEOL,扫描电子显微镜,图,2-3,落射式照明原理,暗视野照明方式,相差显微镜照明原理,光学显微镜、,TEM,、,SEM,成像原理比较,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,一种介壳虫的染色体（,PCM,照片）,DIC,显微镜下的硅藻（伪彩色）,内质网透射电镜图（伪彩色）,冰冻蚀刻电镜照片,第一章 显微镜,第一节 显微镜的种类,分为光学与非光学,单式与复式,1,单式,最简单的显微镜，通常的放大镜。,10,倍以下，只有一个透镜。构造稍微复杂的是解剖显微镜，,200,以下，由几个透镜组成。扩大镜的原理如图,1-1,。,眼睛在,F,处观察，就可以看到放大的像。,2,复式,实验室常用的，结构比较复杂，倍数比较高，由,2,组以上透镜组成。复式显微镜主要有三部分组成，目镜、物镜和集光器。复式显微镜种类很多，除了一般常用的明视野显微镜外，还有各种类型的显微镜，如暗视野、相差、偏光、荧光等。,图,1-2,复式显微镜光路图,第二节显微镜的光学原理,1,物镜,物镜的性质,放大倍数 注明于物镜的镜头上，常用的低倍镜为,10,，高,40,，油镜,90,。放大倍数计算方法如下：,物镜的放大倍数,=,相当的光学筒长,/,物镜的焦距,光学筒长,=,物镜上焦点平面到目镜下焦点平面的距离，例如，物镜焦距为,16,毫米时，常与,160,毫米的光学筒长一起使用，则放大倍数为,10,。,工作距离 指物镜最下面透镜表面到盖玻璃片上表面的距离。工作距离与放大倍数成反比。,表,1-1,标准物镜的性质,焦点距离 焦距是指平行光经过单一透镜后集中在一点，由此点到透镜中心的距离。与物镜倍数成反比。表,1-1,焦点深度 在不用倍数的物镜观察物体时，所能看到的清晰范围是不同的。例如，,10,物镜观察一个细胞，则看到上壁就看不到下壁，反之也是如此。这样，在视野中垂直范围内所能清晰观察到的界限，就称为焦点深度。与物镜倍数成反比。焦点深度与显微镜照相有密切的关系。,分辨力 物镜的分辨力是指分辨被检物体细微结构的能力，也就是判别两个物体点之间最短距离的本领。设这个距离为,R,，若大于,R,，则分辨出，否则不能分辨。,分辨力公式：,镜口率也叫数值孔径，与标本周围介质的折射率和透镜视锥半顶角有关。,公式为,N.A.=n*sin,/,2,例如，若射入的光线为,0.55,微米的绿光，物镜的镜口率是,0.28,，,0.65,和,1.25,，则分辨力为,1.0,，,0.42,和,0.22,微米。,物镜的类型,常用物镜有,2,种，即消色差与复消色差物镜。前者用于一般实验室工作用，后者用于精细的研究和显微镜照相。,消色差物镜 所谓,色差,是指光线通过一个透镜后，不能使所有的颜色（红,-,紫）都聚在一个焦点上，而是参差不齐。如图,1-3,。,造成的原因是由于各种颜色的光线波长不同，通过双凸透镜后它们的屈折角度也不一样，因此造成了各种不同的焦点。通常红光造成的焦点离透镜最远，紫光造成的最近。所造成的象也不清晰，成为一个由五彩圆环所组成的小圈（红色在（中心），这种现象叫做色差。,这种消色差透镜系由含铅的火石玻璃的单凹透镜和含钙的冕牌玻璃双凸透镜黏合而成。图,1-4,。这种透镜可使红蓝二色光线焦点重合。不能校正所有光线，而只能校正黄绿的球面色差。,色差是可以矫正的，校正这种色差分散缺点的透镜叫做消色物镜。由消色透镜构成的物镜叫消色差物镜。,复消色差物镜 一个单透镜除出现上述的色差外，尚有球面色差。所谓,球面色差,就是透射于透镜边缘的光线的屈折度大于中央部分的，因此造成的焦点有参差，不在同一点上，图,1-5,。这样，就使造成的象不明晰，而且还变形。可用校正色象差的复合透镜来校正，这种透镜叫复消色差物镜，它即可校正球面色差，也可校正色差。,凡是由几组透镜所构成的物镜，既能消除色差，又能消除球面色差的，就叫做,复消色差物镜,。标准的复消色差物镜如图,1-6,。,由于复消色差物镜还不能完全将色差消除，所以用特制的补偿目镜来配合使用，以除去这种物镜保留下来的色差。,
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