免疫组织化学技术培训课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组织化学技术,*,免疫组织化学技术,抗原抗体,（特异性）标记物，,原位,显示组织或细胞内抗原的一门技术。,2,免疫组织化学技术,根据抗体标记物不同：,酶,-,免疫酶组织化学,荧光素,-,免疫荧光组化,胶体金,-,免疫胶体金组化,高亲和力物质,-,亲和免疫组化,3,免疫组织化学技术,其中，,免疫酶组织化学,应用广泛,以其为例，掌握免疫组化,基本原理,免疫酶组化特点：,信号定位准确,标本可长期保存,阳性标记与病变关系,方法简便，易推广,4,免疫组织化学技术,酶选择标准：,该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。,酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。,酶易于纯化，获得纯制品。,酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。,酶在PH中性液内较稳定。,组织中不应存在与底物作用的内源性酶。,5,免疫组织化学技术,符合上述条件：,辣根过氧化物酶-HRP,硷性磷酸酶-AKP,葡萄糖氧化酶-GOD,6,免疫组织化学技术,（一）辣根过氧化物酶,（HRP）,分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位,稳定，易获得较高纯度酶,具有较高活性及特异性,可溶性佳，生成的产物不扩散,组织中内源性酶较少,可作用于多种底物，产生不同颜色,HRP穿透力强，易进入细胞内,7,免疫组织化学技术,HRP,的底物：,低浓度的,H,2,O,2,，供氢体为,胺类,及,酚类化合物,。,HRP显色反应：,HRPH,2,O,2,HRPH,2,O电子供体（氧化型）,电子供体,电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。,8,免疫组织化学技术,HRP,常用的电子供体：,3.3-二氨基联苯胺(,DAB,)棕色,氨乙基卡巴唑(,AEC,)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。,4-氯-1-茶酚（,4CN,）蓝色，易弥散，不能久保存,3.3，5.5-四甲基联苯胺(,TMB,)黄色,9,免疫组织化学技术,（二）硷性磷酸酶,（AKP）,从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取,组织穿透能力较弱,内源性AKP较高,左旋咪唑具有抑制作用,10,免疫组织化学技术,AKP,底物：,AKP常用的底物为,-萘酚AS-B1磷酸盐,偶联试剂：固兰BB蓝色,固红TR红色,11,免疫组织化学技术,（三）葡萄糖氧化酶（GOD）,底物为葡萄糖，终产物稳定,体内无内源性GOD,分子量大，穿透力较弱,12,免疫组织化学技术,第一节,基 本 原 理,13,免疫组织化学技术,酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。,一、酶标记抗体法,14,免疫组织化学技术,组织抗原,第一抗体,过氧化物酶,直接法,（一）直接法,原理：,HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原-抗体 HRP复合物,15,免疫组织化学技术,步骤：,一步完成,优点：,简便、省时,特异性强，,非特异染色轻,缺点：,敏感性差,一种标记抗体只能检测一种抗原,16,免疫组织化学技术,组织抗原,第一抗原,第二抗体,过氧化物酶,间接法,（二）间接法,原理：,HRP标记在第二抗体上，,抗原-特异性抗体-第,二抗体 HRP复合物,17,免疫组织化学技术,优点：,较直接法敏感性高,一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原,缺点：,较直接法费时,非特,异性染色稍重,步骤：,二步法,18,免疫组织化学技术,制备抗酶抗体,制备PAP复合物,19,免疫组织化学技术,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP,二、酶桥法,原理：,HRP标记在抗酶抗体（三抗）上，抗原-特异性抗体-第 二抗体-第三抗体 HRP复合物,一抗、三抗有何关系？,20,免疫组织化学技术,优点：,与酶标记抗体法相比，敏感性高,（酶与三抗通过抗原-抗体反应 结合，避免直接标记引起两者活性降低）,缺点：,较费时,步骤：,四步法,21,免疫组织化学技术,一、,PAP,法,原理：,抗原-特异性抗体-第,二抗体（桥抗体）-,PAP复合物,22,免疫组织化学技术,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,HRP,三、PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法）,原理：,与,酶桥法,相似，不同之处是将酶与三抗制备成PAP复合物。,抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗）-PAP复合物,23,免疫组织化学技术,优点：,敏感性较高,背景染色较轻,局限：,特异性抗体与PAP必须为同一种属动物,步骤：,三步法,24,免疫组织化学技术,优点：,非特异背景较轻，不受内,源性酶的干扰,缺点：,产物易溶于有机溶剂,步骤：,三步法,26,免疫组织化学技术,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,HRP,四、双PAP法,原理：,在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物,抗原-特异性抗体-二抗（桥抗）-PAP-二抗-PAP复合物,27,免疫组织化学技术,步骤：,五步法,优点：,敏感性较高,缺点：,步骤多，费时,非特异性背景重,28,免疫组织化学技术,Avidin-,一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成,Biotin-,小分子维生素,Avidin和Biotin具有较高亲和力，比普通抗原抗体亲和力,高百万倍,以上,五、亲和免疫组化,29,免疫组织化学技术,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物素,亲和素,原理：,酶标记Biotin形成酶素化,Biotin,（一）,ABC,法,(Avidin-Biotin peroxidase-Complex method),酶素化BiotinAvidin-ABC复合物,抗原-特异抗体-Biotin标记二抗-Avidin Biotin HRP,30,免疫组织化学技术,步骤：,三步法,优点：,敏感性较高,特异性强,应用范围广,缺点：,某些脏器存在内源性生物素干扰,Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应,31,免疫组织化学技术,（二）SABC法,（Streptavidin biotin Peroxidase Complex）,比较亲和素，链霉亲和素造成的背景着色浅,SABC法已代替ABC法,32,免疫组织化学技术,（三）,LSAB,法,（,Labelled Streptavidin Biotin Method）,-又称链霉亲和素-过氧化物酶法（SP法）,原理：,Biotin标记第二抗体 HRP标记Avidin,抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin HRP复合物,33,免疫组织化学技术,步骤：,三步法,优点：,敏感性高,特异性强，,背景浅淡,方法简便,34,免疫组织化学技术,六、多聚合物酶法,35,免疫组织化学技术,组织抗原,一抗,HRP,多聚骨架,（一）,Epos,法,（,Enhanced polymer one-step staining）,原理：,采用一种具有惰性的,多聚化合物,作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成,HRP-多聚合物-特异性 抗体,。,36,免疫组织化学技术,步骤：,一步法,优点：,快速，简便，特异性强，,敏感性高,缺点：,商品化种类不全，,价格昂贵,37,免疫组织化学技术,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,（二）EnVision法,（Enhanced Labelled Polymer System）,原理：,HRP-多聚合物-第二抗体,38,免疫组织化学技术,步骤：,二步法,优点：,敏感性高,（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体）,特异性强（复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰）,39,免疫组织化学技术,