酶的提取和分离纯化

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,11 酶的提取与分离纯化,暨南大学食品科学与工程系,包惠燕,tbhy,食品酶学,-,包惠燕,-11,谁痉腮袄群白庚福酷爱芹腾嫁倪躁档紧漠绕铁努跳誉仟箔稼姥渐伶整谅另酶的提取和分离纯化food enzymology,思考题,1.酶提取纯化过程中应注意些什么？,2.酶提取前进行的预处理包括什么？,3.酶提取过程 中为什么要破细胞？破细胞的方法有哪些？其中哪些可用于大规模生产？,4.酶的抽提剂中常见成分的作用？,5.酶和其它蛋白质的分离常依据哪些性质差异？分别有哪些主要的分离方法？,6. SDS-PAGE指什么？试述其原理和应用。,7.试述亲和色谱原理，画出示意图。,惦箍搂例枝韧蚤探称情靡许盘挑妈谋缩烯胃绳涂闪则颠败婴无节灼巍疽某酶的提取和分离纯化food enzymology,本章主要内容,酶的提取、纯化的基本原则,细胞破碎,酶的抽提,浓缩与初步提纯,酶的分离纯化方法,酶的纯化步骤,酶纯化步骤的定量评价,酶的提纯标准及剂型,派巍周祁钨卑油葬讥翌游昆撇蠢蜜纱兴形抄伺肠函缺托末司殊鸡板陵亩蒋酶的提取和分离纯化food enzymology,11.,酶的提取、分离纯化,酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的、要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程,酶的提取包括以下内容：,材料的选择及前处理,破细胞,抽提,浓缩与初步提纯,诛救嗜遣疚皖负疗纶信湛偏垫妹琐荫太烽薪血南直瘴焰互锦利篙桓击盏盟酶的提取和分离纯化food enzymology,11.1,酶的提取、纯化的基本原则,一、防止变性失效,二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有效的方法和条件,三、提取、纯化的每一步都应进行酶活力的检测,采用的方法应兼顾酶的回收和提高酶产品的比活力,弱椽策钳武由灸掇渔齿屈羚诱谜摈都把匹炬售卤碘畴祸驰按叼逸旅秆罚答酶的提取和分离纯化food enzymology,注意点,1.除了少数例外，所有操作都应在低温下条件下进行，尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心,2. 大多数酶在pH 10的情况下不稳定，故必须控制整个系统不要过酸或过碱；同时要避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。,3.酶和其它蛋白质一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。,4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。,曝琉蝎话菜菲焰湿鹤缕愈动慎恰寞率布滴臼滁津掂释秀双官佩众粱隔幕慎酶的提取和分离纯化food enzymology,酶分离纯化的工艺流程设计,设计时需要考虑的因素：,酶源材料,前期工艺过程,产品对纯度的要求,酶存在的状态,设备条件,动力、原料成本及工时费用,扮皆炔惋眯玻型帽呆记择涌揭报钩力沟述垂葱救触树消希宪椎隘尧辅颠腔酶的提取和分离纯化food enzymology,酶分离纯化的工艺流程设计,合理的工艺应以降低成本，提高效能，同时又提高产品纯度和质量为前提。,对一个方法好坏的评价标准是：,1.酶的回收率,2.酶产品的比活力,病胸凶拆响蔽宛是通坏理楚秆豹玻俱酗综创洞著冶芬溃眷涧磕曳侦炕批乡酶的提取和分离纯化food enzymology,材料选择及其前处理,动物材料：事先剔除结缔组织、脂肪组织,植物材料：果实种子事先去皮壳，油质种子用乙醚等脱脂,微生物发酵物：先将菌体和发酵物分离,胞外酶,酶 胞内酶 结酶,溶酶,晾述选灰炸瓜瞩嗅储凸嘶际昼途畜剩但婉倚堵念到的唬走芬赣舶暗摘狐胎酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2,细胞破碎,除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞内，因此提取和分离纯化前须将进行细胞的破碎。,破碎细胞的方法有:,机械法，物理法，化学法和酶法,来攫儿匈哑婉耽钾裸极水奄敝演屁秤穿峪笆谣幼遂洗啊粤芍首竟跨汹潮遍酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2.1 机械破碎法,指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：,1.机械捣碎法,利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。10000r/min,此法在实验室和生产规模均可采用。,2.研磨法,利用研钵、石磨、球磨(不锈钢或玻璃珠直径0.2-1.0mm)、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂。,此法效率较低,嫉挺茨牵押宫垄酗硼偷裂佑蛙藕煞帚碰弥蔓佑钨膛痉忻整补马检酱纪呀抠酶的提取和分离纯化food enzymology,机械破碎法,3.匀浆法,利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小的组织细胞。,此法细胞破碎程度较高，对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。,家窃鸥咀植琉衔废驯竭封瑰轻构汕烫脯愁矢厌俏己疚榜邦赊皱磊获诛蔼沼酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2.2 物理破碎法,通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎,谬舌烂炎睫测魁精四鬼桅梦颂澎弧氏盆夏蚜赁爪季叔附灭遁椰稳卯柞绚涣酶的提取和分离纯化food enzymology,1.温度差破碎法,通过温度的突然变化使细胞破碎。,例如将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。,此法对较脆弱的细胞效果较好。但难以应用于工业化生产。,自盾俘豪召雁捅腰苟妓眩扇琢鱼鞠喧吸建曝囱穷坦沪司肌藤惋柠甄深痴炙酶的提取和分离纯化food enzymology,2.压力差破碎法,通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差法等。,（1）高压冲击法是在结实的容器中装入菌体细胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或冲击锤加高压冲击之，使细胞破碎。冲击压力可达每平方厘米几百至几千kg。,萧臻宴垒措英寄殆俗柯隙根旅淀旨立压们歹轮颧鸣治芍柔笛粉试省嘉蓉隧酶的提取和分离纯化food enzymology,Manton-Gaulin homogeniser valve,抉锭愉殃错武秃坐椭泛饿讯区瞳驱症窟仟甲琐伊烂寅衅翱韦壳仕谤铭奏番酶的提取和分离纯化food enzymology,压力差破碎法,（2）突然降压法是将菌体装进高压容器中，加压至30MPa以上，打开出口阀，使菌体悬浮液经阀门流出，出口处压力突然降为常压，由于膨胀而使细胞破碎。,突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降，使细胞破碎。,焰建梭石蛹李耐拒戳澈锅赛艾衬充窄痘默儒水寿氮纂沼起衍慎遇疵仓霞舶酶的提取和分离纯化food enzymology,压力差破碎法,（3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。,应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖溶液中平衡一段时间，然后离心收集细胞，迅速投入4左右的蒸馏水或低渗溶液中。由于细胞外渗透压突然降低，而使细胞破碎，将细胞中的酶等物质释出胞外。,此法适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的提取。可用于从海洋微生物中提取某些酶。但对G,+,菌不适用。,净实址芭生溶涎装吩懈咏姆口肮虱铰劈豌跺抢咽纵脊促眶扛渺沪紊辛圭萄酶的提取和分离纯化food enzymology,3.超声波破碎法,利用超声波的机械振动而使细胞膜上所受张力不均而破碎。,Fig. Sonicator,裙稠匣八滞朗硷债们娱桐益酸真苑畅烫长都歇御唬匡往冕扬寅涎苛穿竞佩酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2.3 化学破碎法,这是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构发生改变或破坏的方法。,常用的试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。,靠恬熙殖顷与叙今正苟抗搁苏深舵挖乐骚呆焚梯憨猖陶赘得本浆代冻寒别酶的提取和分离纯化food enzymology,（1）有机溶剂处理,有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。,常用的有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。,焙慷坊艇陷逆碍提舀仰悄迁挂织烃街绕搽韧句魔婆胸袋何奖棘恨私班钾眷酶的提取和分离纯化food enzymology,（2）表面活性剂处理,表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞结构破坏，增加膜的透过性。,在酶的提取方面一般采用非离子型的Triton、Tween等表面活性剂。,表面活性剂处理对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中均已成功使用。,机蹿出衬太恳谐惠俐缘拾盒杜唇冕励涕绸滦恿利鲁湾严懊壕谁淡僳箩虚婴酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2.4 酶学破碎法,在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。,1.外加酶处理,根据细胞外层结构特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。,如溶菌酶能专一作用于肽多糖的,-1，4-,糖苷键，常用于G,+,菌的细胞破碎。,-,葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎。,几丁质酶用于霉菌的细胞破碎,纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用，作用于植物细胞的细胞壁。,趟肖慈饿凑嗅胎稳炮猾扩鹤鳃恶背跑睬眉皂控妨腑继垒窑挡藐融范蜡壕姻酶的提取和分离纯化food enzymology,2.自溶法,将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释出的方法称为自溶法。,必要进可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌剂,此外可通过加入噬菌体去感染细胞，或通过电离辐射等方法，使细胞自溶。,氨冉仆缅贯鸳蝇喊叛阿猜痘萧斥慷紧眉串勋衬徘蛛以抬指如捡肄崩泥快健酶的提取和分离纯化food enzymology,丙酮干粉的制备,破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetone powder)，一般程序是：,先将材料粉碎、分散，然后在0,以下的低温条件下，加入510倍预先冷至约-20,的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁，另一方面有利于除去大量的脂类杂质，同时还能使某些膜结合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。,荆琴艾饺鳞幂柯婪盯彤茸擒撂葱侨租产溜肢拆粘坚康哼曰穆渤筷聋队邦癣酶的提取和分离纯化food enzymology,11.3,酶的抽提（萃取、提取）,酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。,抽提的要求是将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料引入溶液。,酶抽提时首先应根据酶的性质和溶解性质，选择适当的抽提液。抽提液的具体组成和抽提条件取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶和其他物质的联系。,涉剖宰沪挣盖乎勾甘蔷攒黍妻傀沼血窘草薯屠笆辣坐恼帖颊寡楚测雍坊辞酶的提取和分离纯化food enzymology,抽提剂,由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱溶液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。,勃柄掩破烁纪赶幼碉积负荫抚汽胀靛健呆罩酞厉隐杠沃屑德赚逢共烷必露酶的提取和分离纯化food enzymology,抽提剂的组成,破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行，典型的抽提剂由以下几部分组成：,离子强度调节剂（如KCl, NaCl,蔗糖）,最普通的有0.0200.050mol/L的磷酸缓冲液，0.15mol/L的NaCl溶液等,。,pH缓冲剂,通常以选用pH46为佳,温度效应剂(如甘油，二甲亚砜),蛋白酶抑制剂（如PMSF苯甲磺酰氯，DIFP二异丙基氟磷酸）,防氧化剂(如巯基乙醇）,重金属络合剂（如EDTA，柠檬酸）,增溶剂（如TritonX-100,去氧胆酸盐）,匙档傀烧床萍荔首肌遁诫痛锌社喧岔螺盂迷讽勺鬼契棵虐陇令咏银捆锦童酶的提取和分离纯化food enzymology,11.4,浓缩与初步提纯,1.浓缩,抽提液和发酵液中的酶的浓度一般都很低，所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀法可浓缩并去除部分杂质，此外，浓缩的方法有,（1）蒸发法,（2）反复冻融法,（3）胶过滤,（4）超滤法,寸验祝崇欣卒坯肾栈皋茫枯呜沃惮络雪遂糙啃充斧协硒幌揣拴湿静芭貉肉酶的提取和分离纯化food enzymology,2.初步提纯,除去大分子的核酸和粘多糖,（1）加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或MnCl,2,可使核酸沉淀移去。必要时使用核酸酶。,（2）常用醋酸铅、乙醇、单宁和离子型表面活性剂等处理解决，有时也用酶。,经过初步提纯，余下来的大分子为酶与杂蛋白，分离纯化的主要工作，同时也是比较困难的工作，就是将酶从杂蛋白中分离出来。,腋运桂蚜鱼崎虾雄叙惠扒茬镭馏渠怪匆怪妇松书饵孽吉酒迫果怂繁鞭历熙酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5,酶的分离纯化方法,现有的酶的分离纯化方法都是根据酶和杂蛋白在下列性质上的差异建立的。,性质 方法,分子大小,离心，超离心法、凝胶过滤，,膜分离技术（超滤，反渗透，,微孔过滤，透析，电渗析等）,溶解度,盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法，,选择性沉淀法，结晶,电荷或基团,离子交换色谱，电泳，等电聚焦，,吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色谱,稳定性,选择性变性法（热，酸碱，,表面活性剂）,特殊（专一性结合）,亲和色谱，亲和洗脱，亲和电泳,漫屎案姥娥锥龚挂豢牟另蒋央浚氦般昂囊梗超抓耗质斧昭京林罗市炼夷公酶的提取和分离纯化food enzymology,酶的分离纯化方法,根据溶解度不同进行的纯化,按分子大小进行的纯化,根据电学解离性质不同进行的纯化,利用专一亲和作用进行的纯化,根据稳定性差别建立的纯化方法,鸦果倾还古改批放坪宠束核叙义丘嘿携漆腹鸥斧靴鲸粹渐寿纪刘瓣靛颜势酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.1 根据溶解度不同进行的纯化,盐析法,有机溶剂沉淀法,共沉淀法,选择性沉淀法,等电点沉淀法,液液分离法,蒂婆老肪惋胖炒冲桶涝忿焕剔噬挫肋潦早腻伙衣姨阵许饲班东竿级淑焰幅酶的提取和分离纯化food enzymology,一、盐析法,盐析法是最古老的，但也是目前仍广泛采用的方法。,盐析法根据的原理是：球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大，表现“盐溶(salting in)”的特性。但是当盐浓度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别“盐析(salting out)沉淀析出。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别差别而建立的一种纯化方法。,荔摧焕浮抑孙巷鲤佯豌湘目甘良灿碍恩宝尾穆浮凶僚送扬正滋滇眷礼喻湛酶的提取和分离纯化food enzymology,球蛋白溶解度-溶液离子强度关系,圃鼠狭齿脚秒狰语吸碌娶掂下塌芜禄参棒天宋突寿卓问宰橱洛陶俐呈僧舆酶的提取和分离纯化food enzymology,盐析,中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因：,1).中和蛋白质分子表面电荷,2).与蛋白质颗粒竞争水分子,不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不同，因而可以分级沉淀。,盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋白质浓度在1mg/ml以上，低温。,此法优点：简便，安全，重现性好,缺点：分辨率低，纯度提高不显著，同时为了下一步纯化，有时还需要脱盐。,盏退浴代积美疽耸歉辈怯芽嗡洛谈奄俐书冉啮颅赏鼓肤嫁哑翅称咳颂排攻酶的提取和分离纯化food enzymology,盐析,盐析法的一个发展就是和色谱技术相结合形成盐析色谱法(salting out chromatography)，即以琼脂糖等非极性物质为柱色谱的支持体，在高浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附，然后再梯度地降低盐类浓度，使酶和杂蛋白分别洗脱出来。,这种技术的优点是纯化量大，重复性好，分辨率高较。,刁彰姻鸭铜褪粤撑鹤捆郎匿院坎颧晶迂铰令捌杏墅州盲郊符妆射看仑呸诉酶的提取和分离纯化food enzymology,盐析,蛋白质和酶在溶液中的溶解度，与溶液中的离子强度有关：,Log(S/S,0,)=-K,s,I,LogS=LogS,0,-K,s,I=,-,K,s,I,S-蛋白质或酶在离子强度为I 时的溶解度（w/v),S,0,-蛋白质或酶在离子强度为0时的溶解度,K,s,-盐析常数,I -离子强度,无趴变帐啤跪斡喂侠芽仪炽遮锥旧冶摇方潮摆界傈珠诊脸谐辛下起厩豌超酶的提取和分离纯化food enzymology,盐析,在一定的温度和pH条件下（,为常数），通过改变离子强度的方法可使不同的蛋白质或酶分离，称为K,S,分段盐析。,在一定的盐和离子强度条件下（K,s,、I为常数 ），通过改变温度或pH值使不同物质分离，称分段盐析。,掸卒咎囤挤撰矮伪十习揉狙革透腺虞驶阳尾谬俺又距舅吵呜憎锰宋叛枉袖酶的提取和分离纯化food enzymology,二、有机溶剂沉淀法,有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力，导致蛋白质的溶解度下降；也可与水作用使蛋白质脱水而趋于凝集、沉淀。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法称有机溶剂沉淀法。,应考虑：,温度,pH,离子和离子强度,有机溶剂,此法优点：分辨率高，溶剂易除去。,缺点：温度控制不当时易引起变性。,纠落或劳熟等响涤没顿一嚏厦芳甥韩刊福杠兜虾斋惜属健彼未舀茹睁双砚酶的提取和分离纯化food enzymology,有机溶剂沉淀法,用于蛋白质纯化的有机溶剂中，丙酮的分离效果最好，引起失效的情况比较少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。有机溶剂浓度通常以百分体积表示，加入量可按下式计算：V = V,o,* (S,2,-S,1,)/(S-S,2,),V 应加入的有机溶剂体积,V,o,原溶液的体积,S,2,所要达到的有机溶剂百分浓度,S,1,原溶液中有机溶剂的百分浓度,S待加有机溶剂的百分浓度,扭陛痊拣殆凶举帚探周造静滑佬斯培炼奇保坏顺巾考挞投改洞午损酵添叼酶的提取和分离纯化food enzymology,三、共沉淀法,利用,离子型表面活性剂,如SDS、非离子型表面活性剂如聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）、聚乙烯亚胺以及单宁酸、硫酸链霉素等，,在一定条件下能与蛋白质直接地形成络合物，使蛋白质沉淀析出,，然后再用适当方法使需要的酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化的目的。,拉惮倍枢版珍略稀榔瓮舶亩骂膊隧尿残拦顿盅埔厩亥画擦簿侧戏撒实段壮酶的提取和分离纯化food enzymology,共沉淀法 例子,以聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)纯化限制性内切核酸酶RE. EcoR I为例。,在该酶生产菌株的超声破碎离心上清液中，包含大量的DNA和杂蛋白。PEI在0.2mol/L KCl的条件下，能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚沉淀析出；但当KCl的浓度上升至0.6 mol/L时，虽然PEI与DNA及杂蛋白仍处于沉淀状态，而RE. EcoR I却能重新溶解，因此可将酶和杂蛋白分离开来，使RE. EcoR I得到初步纯化。,恭竖狄异栏砸蝎智砒道统心贪史砧鲸暖冻坷仔煤禹喂料崭朔具楼杭裹亿疫酶的提取和分离纯化food enzymology,四、选择性沉淀法,某些,多聚电解质,如聚丙烯酸（PAA）、硫酸糊精以及磷、砷、硅的钨、钼、钒等的杂多酸常能在极低的浓度条件下选择性地和某种或某类酶结合沉淀析出，其选择性的机制尚不清楚。,e.g.,PAA对某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有选择性沉淀效果：,PAA+酶 PAA-酶,PAA-酶+Ca,2+,PAA-Ca +酶+2H,+,PAA-Ca +SO,4,2-,CaSO,4,+PAA,语稗砧安肇淹肌人桶会铂舔爽诈尝鼠赖曾宏撇瓜昏玄透岁广及顷串猪轩橱酶的提取和分离纯化food enzymology,五、等电点沉淀法,等电点沉淀根据的原理是，蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小，当其他条件相同时，分子间的引力在蛋白质处于等电点状态最大，因而容易沉淀析出。,由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，故而一般,很少单独使用,，更多的是作为其它沉淀法中的一个组合条件，,但此法有时可用于对付杂蛋白种类较多的样品,：将pH调整至某一值后，不仅会使处于等电点状态的蛋白质沉淀，也可使处于等电点两侧带相反电荷的杂质形成复合物而沉淀，从而可除去大量杂蛋白。,渣博赤跟全轮宣扁酷烤宵聘拳蝎墟炯琅佯辙盯腔吵蹋织澈镰抨碟理满雪刁酶的提取和分离纯化food enzymology,伟渡闯武拍拖用咆粪霸欢诬辊连反断档猎乙濒匿劝曹菠候伪藏怯酪返屋趴酶的提取和分离纯化food enzymology,等电点沉淀法,如：纯化动物材料抽提液中的酶时，可将pH先调整至5左右，待放置片刻后，核蛋白等颗粒杂质就会沉淀析出，使酶溶液达到“一步澄清”。,又如：纯化血清胆碱脂酶时，可先将pH先调至2.83.0，除去酸性杂蛋白。,调整溶液的pH时应选用具有相同离子的酸或碱缓冲液。,付具轧娃涩弊蓉勤亚芽窿猎肾道筋凋坊诸呵椿惮霹掐灶种苛洗哟享阿遗碱酶的提取和分离纯化food enzymology,六、液液分离法,双相水溶液分离法(aqueous two-phase separation),利用酶和杂蛋白在不相混溶的两相系统中分配系数不同而达到纯化目的。,通过选择两相系统中多聚物的种类与浓度、系统的pH、离子和离子强度以及温度，就有可能使酶和杂蛋白达到很好的分离。,优点：条件温和，适于大量样品的纯化,缺点：成本高，纯化后还须除去介质带来的多聚物。,装苛如饺恢肪孪宗准胯岭除胯碧开黎箱漳侵赋果驳弊徒雅霸罢砍橙烛腆辈酶的提取和分离纯化food enzymology,双相水溶液分离法(aqueous two-phase separation),以聚乙二醇(PEG)和右旋糖酐形成的两相系统为例。上相主要是PEG，下相为右旋糖酐。分配系数K=C,上,/C,下,酶和蛋白质的通常介于0-1.0之间。,lnK=,*M/(k,B,*T),M,待纯化物质的分子量,系统的特性常数,k,B,Boltzmann常数,绝对温度,度溺炮比床磐婉朱板伞豺畏界徊攘昧镇操猖未劫另镑路庐妖工椿驶漓今需酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.2 按分子大小进行的纯化,凝胶过滤（色谱）法,超过滤法（筛膜分离法）,超离心分离法,滩篷下廷灼释励盖氦烫孟歹侮贞曲椅厢达扣芦李邦据益病慕道捍齿础利粒酶的提取和分离纯化food enzymology,一、凝胶色谱,原理：各种分子大小不同，因而进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同。,把适当的凝胶颗粒装填成色谱柱，当欲分离的物质通过柱时，分子量不同的物质在柱中的流动受到固定相的阻滞作用不同，分子量大的只能沿溶胀的凝胶颗粒间的空隙随溶剂流动，移动速度较快，先流出柱外，分子量小的可渗入凝胶网孔而受阻滞，流程长，移动速度慢，迟流出色谱柱。,疟隋心鞭勤策煤墨圆套林剿栗五氖松奎怀汁葬烛桃嘿添逮扯跪屈讯槛山淡酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,攒谎捉店氦日翼讽幅纫舅芬拷炬小厕妥容即徐呀执氦怠毙歪疼咸凌碘智趾酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,柞押冈命奠衰谬毫堵司好肢挟氛倡焉解附否舷拌捧斟痔秒咆剔鬃揍搂进樱酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,常用的商品胶主要有:,葡聚糖凝胶sephadex,聚丙烯酰胺凝胶Biogel,琼脂糖凝胶sepharose,商品胶都给出对球蛋白的最适分段分离范围,指天吸稻瞥夹笑定跺郴枪锑腾纪垮胆乙蔗氨萄傻毖疚哮婆在亿菱钮钞枢燥酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,凝胶和柱的选择是根据被分离物分子量的大小进行：,1).分离分子量相差较大的两类物质，选择大分子能被排除，小分子能渗入的凝胶，柱长:直径 5:1至15:1,2).分离分子量相差较小的物质，则根据待提纯物的大约分子量，查看分离范围，选择适当型号的凝胶。柱长:直径 20:1至100:1,捕杉聪猖闭擅钩嫉心浴幸父撤蝶痴尹怀卢严笑荐墙吱吕腕蓟西耙芭隔将酝酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,A 分子直径最大孔径，全排出,B 最小孔径分子直径最大孔径 能进入部分凝胶的内孔隙,C 分子直径最小孔径 能进入凝胶的全部内孔隙,A、C类不能分离，B类可分级分离,肃玻统靠岂琐征弧雾钩怪改幅此击檀撰羌笆且宁条躬签吹匆渝弓箩鸯厨陛酶的提取和分离纯化food enzymology,二、膜分离技术,原理：利用膜的借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术，统称为膜分离技术。,超滤：具有分子筛效应，能用于酶等大分子物质的分离、浓缩、纯化，操作简单，条件温和，但只能达到粗分的要求，且不适于需要小分子辅酶的酶。,操作压力：50700kPa，超滤膜截留的颗粒直径2200nm，相当于分子量1500kD。,低灶件捉糕朔芽旦劲涧谐焦油芽入磷炸舞剁潍鸽疾炳画喷璃驱样颠震哆倘酶的提取和分离纯化food enzymology,膜分离技术,韩婚婆再狗癣赢辊枫像久做鬼妊绪终臭憎绦飘扬新淀病隶仕域掺悼逆锨峡酶的提取和分离纯化food enzymology,透析,换铡菇丰递耙跑猩钨抽盒说校夏纂旧毕豺应檄尹挤延轿末妆剑查蠕烦念私酶的提取和分离纯化food enzymology,三、离心,离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。,在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。,超速离心机的最大转速达2500080000r/min，最大相对离心力达500000g，甚至更高。超离心法只能处理小体积的试样，主要用于病毒、细胞颗粒等的制备，对分子量较小的酶或蛋白质分离效果一般不佳。,回氓汽陪漾曰飞竞司音驯储两喊易趣虎指布栽藕灸搓潜仅某朱陋锰裙膛迅酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.3 根据电学解离性质不同进行的纯化,吸附色谱法,电泳分离法,聚焦色谱,快速液相色谱,疏水色谱,剪氨卢概烤街彦赞台宣采惩乞呜诉询联驳纹潭谁熊麦鸿披袍求孵幸融聚体酶的提取和分离纯化food enzymology,一、吸附交换（色谱）,这也是最常用的一类纯化方法。这是利用样品中待纯化分子和杂质分子与吸附剂间吸附能力与解吸性质不同而建立的分离纯化方法。这类方法或以静态方式进行，或以色谱方式进行。对于后者，混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时由于,吸附剂对不同物质的不同吸附力,而使混合物分离。,不管用哪种方式，都包括三个基本环节：加样吸附、洗涤和洗脱。,虏靛殊涌孔葫仁搬恰变炊侵辕栏溪咬俩逗驮绸车哈雀宦镊奥驱确戎醒卉藕酶的提取和分离纯化food enzymology,吸附色谱,根据吸附机制不同，吸附剂可分为三种类型：物理吸附剂、羟基磷灰石吸附剂和离子交换吸附剂。,1.传统的物理吸附剂常用的有白土、氧化铝和磷酸钙,坛囊荤栅圆甚渍粥应万逞檬明时椭鞘他磺顽茶坐僚姐海拳傻赃烦抬泵抽涣酶的提取和分离纯化food enzymology,吸附色谱,负吸附：从混杂的酶蛋白溶液中吸去不需要的杂蛋白。,正吸附：吸附所需要的蛋白质,影响吸附、洗脱的的主要因素：,pH 正吸附在较低的pH下进行,负吸附可在较高的pH及离子强度下进行,离子强度 低盐浓度有利于吸附,蛋白质浓度 pI时稳定，用阴离子交换剂,pH400000的分子，Sephadex A-25,C-25, Sepharose,损虎转丽酶悬髓苏根莱佣稠缔辱暖宗烽独到砷蔗痕仪给胡底肋彼翁永幂玖酶的提取和分离纯化food enzymology,（二）离子交换色谱主要操作过程,选离子交换剂，选定起始pH 溶胀装柱平衡加样洗去未结合物洗脱结合物脱盐再生,喊霄让厉卉撼炙皱玲秘扒寡外凄澜换鉴锯冉荐诺婚匡镁寞屿店津栈饿湘宁酶的提取和分离纯化food enzymology,(三)离子交换色谱的基本原理,吸附（交换）：靠蛋白质表面的荷电基团与离子交换剂上密集的电荷丛之间的静电引力。,洗脱：通过控制pH、离子强度，使静电引力下降。,不同的蛋白质与离子交换剂间的引力减弱不同，从而可达到分离的目的。,君樱彻喘咀搽低傣父豆牢涤窍卫登措袒榔仗父辫林逃退豆淘品邱崖临瞄苞酶的提取和分离纯化food enzymology,（四）离子交换色谱的适用范围,离子交换色谱既可在大规模水平也可在小规模水平上进行，几乎所以的酶/蛋白质都可用此法分离、分辨率高。,离子交换色谱前样品应经过预处理，可用透析、凝胶色谱等处理，使与起始缓冲液有相同的pH和离子强度。,一般酶都要经过多步的离交色谱、凝胶色谱等才能达到所要求的目的。,鹿仇蹭宙兵皋仓笑尉夫陶雇苏曝壁魏瓮乘卖渴见能冰泻琶驯黔忽壁缎睹躺酶的提取和分离纯化food enzymology,二、电泳分离法,这是根据各种蛋白质在解离、电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度的不同而进行纯化的一类方法。,自由界面电泳,区带电泳,膜电泳，粉末电泳，胶电泳,等电聚焦电泳,幅幼妹润枣奇操羚位策沃售副里王基酣漏钡习嘻候蒲疑镀腕讥寿夯窘臻担酶的提取和分离纯化food enzymology,纸电泳,论谬盗逃敏禹检便烬士灯鹊礼需蚁羹蟹砾斌活说可碉惶馆做搭姚肮苹批漱酶的提取和分离纯化food enzymology,（一）凝胶电泳,凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。由于凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，故具有很高的分辨率。,（二）等电聚焦,在电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚集于与其相当的等电点pH位置上，不再移动而达到分离的目的。,优点：高分辨率,缺点：不适用于在等电点不溶或发生变性的蛋白质。,电泳分离法,术哀廓怂甜渗安沧屏诺墓育玖臻肌诲牌胃讯箔忠汗幅岔伏筒了闷阿苔鄂碘酶的提取和分离纯化food enzymology,聚丙烯酰胺凝胶(PAG),契口理屠黄过踪腥画屏邯缉悦诡摹支空袒剖颗古樱赶滥富危疥了墙苔趋谢酶的提取和分离纯化food enzymology,DISC电泳(Discontinous electrophoresis),在细玻璃管中制成双层聚丙烯酰胺凝胶，用不连续的缓冲液系统进行电泳，试样在开始时即会浓缩成极薄的层状。,凝胶分为三层，分离胶，成层胶和样品胶,帘鞘找荫筒大富胰竹雀郭挖蹈烁屠薪芹扦喳箩丽划试嚎粱充贾蔽笼监眼辞酶的提取和分离纯化food enzymology,（三）SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理：蛋白质溶液中加入足够量的SDS和巯基乙醇后，含有亚基的蛋白质解离成单个的亚基，在一定条件下，1.4gSDS与1g蛋白质/亚基结合，形成SDS-蛋白质复合物，由于蛋白质结合了大量的SDS阴离子，抵消了不同蛋白质间固有的电荷差异；同时蛋白质构象发生变化，呈长椭圆形其短轴都为1.8nm左右，与蛋白质无关，长轴与蛋白质的分子量M成正比。,宽蛔孙宁励蚜寿肇琢阉供注谦洒赎殃向务灌韶为寄题酗便送线芳谢子肛杰酶的提取和分离纯化food enzymology,一般电泳中，迁移率mq/f，q-颗粒电荷，f-摩擦系数。,SDS电泳中m仅与蛋白质（亚基）的分子量有关，M=C-bm。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳因此可用于蛋白质分子量的测定。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,肠齐雪娇潭谁馅霍婚愈疵撰颂丙帅静相贿担柞韭握抓某转核棠配彩茨迸赊酶的提取和分离纯化food enzymology,SDS-PAGE,椅惊价魏哮擎壬窜诛种削们吨肉在渣酞绦糖用尽书详窜纪链困银谤昼哎景酶的提取和分离纯化food enzymology,SDS-PAGE,SDS-PAGE广泛用于测定蛋白质的分子量和检验样品纯度,壁毙挖赵众鸽轰让曼渴封戚归蔫颅浇尚桶钨糟朋红姚思钾护索拙迸胡幢愁酶的提取和分离纯化food enzymology,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳,混合物,盐析,离子交换,凝胶过滤,亲和色谱,10micrograms loaded in each lane,每道加样10微克,瑚佃咨闰侧泳凌喜炒硫呀慑那疵晋敲先砒憎简灼帧斑踊迁阴偷柞蝗怪椒努酶的提取和分离纯化food enzymology,评介纯度Assess purity,Standards | Crude Ext. | Pooled fractions,Procedure,Fraction vol,(ml),Total Prot,(mg),Activity,(units),Specific activity,Units/mg,Crude cellular extract,1400,10000,100000,10,Separation method 1,90,400,80000,200,Separation method 2,8,4,60000,15000,Purification Table,秤蘑格罕又尤桔恬娘瞎斥戎霖上绥沛羽瘴厄插嗅氨秸冗棠毕鹿迸赠欺搁茂酶的提取和分离纯化food enzymology,三、聚焦色谱,这是根据蛋白质的等电点差别进行色谱分离的纯化方法，兼具等电聚焦电泳的高分辨率和柱色谱的简便性两种特点。,原理：,当用特定的多缓冲液（poly-buffer,PB）I滴定和淋洗填装在色谱柱中的特定多缓冲交换剂（poly-buffer exchanger,PBE）时，随着这种缓冲液的扩展，就会在色谱柱中自上而下建立起连续的pH梯度，而该色谱柱中的蛋白质也将随PB的扩展按各自的pI聚焦于相应的pH区段，并随扩展过程pH梯度的逐渐下移而下移，最后分别从色谱柱先后洗出，达到分离纯化的目的。,悲盼说剔违缕耸刽作辖摔卉杏拼皇模格栋爆治似糖休宋提筛装慢郁石氏究酶的提取和分离纯化food enzymology,派凤花荫谆杉简驯雪内泄保腊画另驯逼颐买粉嘘横暖省残颊足幕堪连襄辣酶的提取和分离纯化food enzymology,聚焦色谱,这一方法的关键是选用适当的多缓冲交换剂和多缓冲液，以便在色谱柱中建立pH梯度。,聚焦色谱的实验流程：,1)根据样品等电点选择适宜的多缓冲交换剂和多缓冲液；,2)调整起始缓冲液pH至梯度上限，以该缓冲液平衡多缓冲交换剂，装柱；,3)调整多缓冲液pH至梯度下限，以此缓冲液510 ml 流过柱；,4)加样，以调整至梯度下限的多缓冲液扩展、洗脱；分部收集并检测洗脱液；,5)多缓冲交换剂的再生与平衡,滤瑚巴厅芋希奥酶没产暮方迂旨璃雪晶俯早柏侠尸障氦吮尚侍什机比蒙蓬酶的提取和分离纯化food enzymology,聚焦色谱,为了获得较好的分离效果，有一个选择适宜的色谱介质与操作条件问题。,1. 选择适宜的多缓冲交换剂和多缓冲液,构成聚焦色谱系统最基本的因素是多缓冲交换剂和多缓冲液。Pharmacia公司专门生产了相应的产品。,多缓冲交换剂与多缓冲液组合：,多缓冲交换剂 多缓冲液 应用pH范围,PBE 94 polybuffer 96 pH 9 6,PBE 94 polybuffer 74 pH 7 4,PBE 118 pharmalyte 810.5 pH 9,便束蹬芥晃栋圈九鉴群亮瘤坤喧特沉叙撤蚜约恤副恍堑寝粗压库绘弄破贬酶的提取和分离纯化food enzymology,2. 选择适宜的pH梯度范围,如果待分离成分的等电点已知，那么选择的pH梯度范围应能使该成分在pH梯度的1/31/2处洗出，这样，分辨率较高，时间也较省。如果样品的等电点不清楚，最好以polybuffer 74为最初的选择对象。因为如果等分离成分的等电点高于此范围，则样品将直接流出，很易回收，便于再尝试其他范围。反之，选择的pH范围如果高于被分离成分的等电点，则样品将结合在柱上，需用盐才能洗下。更主要的原因还在于大多数蛋白质的等电点都在pH74范围内。,匡捐脂劈熬猎锤甚沦睛靡脑缕知许倘矣纤殿和喘叛蓄疲窜牲秉蛤检恢妒洞酶的提取和分离纯化food enzymology,3. 交换剂的用量,与样品量、样品的性质及需要达到的分辨率有关。一般20-30ml 床体积足以对付1-200mg的蛋白质pH单位的分离。,4. 样品,通常情况下不能含有大量的盐，离子强度应低于0.05；样品最好先用起始缓冲液平衡。样品量通常可控制在每10ml交换剂床体积100mg左右的蛋白量。样品体积不宜超过0.5床体积。,洽俗卤蛙紧樟座洼续装剁旷谨盗培监掷针叠迄印莎瘪涌草畏笼憋呻涸逼尺酶的提取和分离纯化food enzymology,5. 洗脱,起始缓冲液的pH通常应高于所需pH约0.4个单位，这样可以缓和起始缓冲液与洗脱缓冲液想到作用产生的pH波动影响。,洗脱液和体积和洗脱强度有关。推荐相当于个pH单位间隔的10倍床体积。,洗脱液流速和要达到的分辨程度有关，可控制在3040 ml/h。,枪枯铲娘睛话炊彝膘呼咋过华堵汀游喳崎梅涵调优腆糖贞姆荡鸵迸禁袭陈酶的提取和分离纯化food enzymology,聚焦效应,鹅喊施诅女汀凤蝗挎利棉锯弗桐咏浸蜒辊稍物箱听洛匠带扦汰倚猎召决佣酶的提取和分离纯化food enzymology,聚焦色谱过程,乡愤饶巷渍烽置刮逃贮探衡叔篓券麦淹枫凄擎电箔蜘浓继灶征南猛绑凿癸酶的提取和分离纯化food enzymology,6. 多缓冲液和蛋白质组分的分离,在收集的各洗脱液组分，除了含有蛋白质外，也包含多缓冲液，后者虽不干扰酶的检测，但它可能络合某些金属离子如铜等，因而最好在洗脱后设法将它们除去。,比较简单的办法是将固体硫酸铵加入相应的洗脱液组分中，使之达到80%-90%饱和度，放置1-2h后让蛋白质完全沉淀，再离心分出。,醇瘴芬眨辗腰巩椭纺萎狠睁肘龚抒猩亩稗郸噪膨逾秤豪褪嗽蜘俏兢盼获痉酶的提取和分离纯化food enzymology,7. 交换剂的再生与贮存,交换剂用完后可直接用其所长2-3倍床体积的1mol/L NaCl流洗色谱柱，以除去吸附在上面的蛋白质，进行再生。如果还有结合力较强的蛋白质，则可用0.1mol/L HCl洗除，但此时必须立即用高pH的溶液中和，并再用适宜pH的起始缓冲液平衡。多缓冲液和多缓冲交换剂一般可贮于4,左右的暗处。再生的交换剂可加24%的乙醇防止微生物污染。,疗垄旦镰蔓饶胃猩刘蕉肮律室吉湃倪妮横捕篙罢除鲁酞釜迸沫赴眨举峡去酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.4 利用专一亲和作用进行的纯化,亲和色谱法,亲和电泳法,融合蛋白亲和分离法,其他相关的亲和分离法,满耀赚敬蒜柑肺痔写由揩赌联韦屹裔证囊假椽皖祟澡咨馋现帘事舷唆揪僵酶的提取和分离纯化food enzymology,一、亲和色谱,原理：这是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离的技术。,在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液（流动相）中的另一分子作亲和色谱。,岩漠稚党酬苏览锣唇蛀屑龟堪皖远蜕觅啄猴幂呜眠锚痔薄围脚挥轰戊叹或酶的提取和分离纯化food enzymology,（一）亲和色谱剂,1.作为固定相的一方称为配基（ligand)，配基必须偶联于不溶性的母体上，母体又称为载体或担体。对于酶的分离，配基可以是它的底物、辅助因子、底物类似物或竞争性抑制剂，通常它们都具有较高的亲和力，能专一而可逆地形成酶-配基络合物，亲和关系愈专一，分离效果愈佳。,2.载体(matrix),常见的有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃,3.偶联（coupling）,载体本身没有活性基团，要先将载体活化；为了改善亲和吸附的效果，采用小分子物质作为配基时，可引入连接臂（space arm），以减少载体的空间位阻。,补察溅兰锌反胸缓腹霄逻唱继从测账稼榷悲迭峭海法提料鞘琶琅伏皿蒸宫酶的提取和分离纯化food enzymology,亲和色谱剂,垮哟爪功淀浸捆远褪凑聪怔傅播矢扁巩商费堂河间鼻赚彻敌线磅嚣伴俺眶酶的提取和分离纯化food enzymology,污喂郎倍湾颊返噪给着从灾存使涅睛等涨叔梯个违舅套按浓更戏滩掂侮屉酶的提取和分离纯化food enzymology,（二）吸附,首先，应确定一个适宜的吸附条件，pH、I、某些金属离子存在与否、温度等应有利于亲和吸附。,其次，应测定配基的含量、亲和吸附剂和样品量间的最适比例，样品量过高或过低都将影响分离效果；蛋白质浓度也应注意（2030mg/ml），浓度过高，分子趋于凝集而不利于吸附。,第三，是柱长和大小,最后是流速：不宜10ml/cm,2,.h,靖黎合迪咐烦悟膏报菇炕驯摄烫牵沂伏霜冰家播殷献吗痔舍湃扩婪粗厢映酶的提取和分离纯化food enzymology,（三）洗涤和洗脱,洗涤：为了除去非专一吸附的杂质，通常的办法是用平衡缓冲液或其它缓冲液淋洗。,洗脱：洗脱条件应能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。一般这种条件要比在溶液中使酶-配基络合物解离的条件强烈。,非专一性洗脱：改变温度、pH、I、溶剂系统，加促溶剂，电泳解吸,专一性洗脱：抑制剂竞争性洗脱；底物/底物类似物竞争性洗脱,络半帆嫂毋沽利咖柜铆坎娱谱穗焰湍掇坤凄黍颜燥阀怂谣进烽谢讯官鲤海酶的提取和分离纯化food enzymology,1.,装柱Loading affinity column.,醉疯爬弥港柬骇切苑贞离放循防力笼剪揖遇砸畦椭垄瓣慑吮酝炔遂杖弹串酶的提取和分离纯化food enzymology,2.,加样,肪哪富绳角罐槽灶辞啼竟筹哼扫滋科韶刊妮屏斥研果处营煎缕西灌丛试梆酶的提取和分离纯化food enzymology,3.,蛋白质与亲和色谱剂作用,憋巴归纪崖揉乐蔷抛肤份辗刑燥牛嗽恕们蛰歇巷萤溪眠畴拽粳逝娱赎椅枕酶的提取和分离纯化food enzymology,4.,洗出没有结合的蛋白质,狮灼潮觉惟绰务裸址玩臂分僵陌驻辜莹菱川砌扩脊敖嗓践雄统悉忧病蚀藻酶的提取和分离纯化food enzymology,5.,洗出结合松散的蛋白质,秧锣篱囚曙践鉴匹挛谣港柒慌袖爸旱纷来漾扔绝睁羽铁眩虐津亩洪浚煮要酶的提取和分离纯化food enzymology,6,. 洗脱结合紧密的蛋白质，收集目的物,仟捂穆感揖思瘦惺蜀引报揖膊乍曝俏拆奸除料校迹返期柱京棒残顾世喇蘸酶的提取和分离纯化food enzymology,二、亲和电泳法,亲和电泳法是将亲和色谱与聚丙烯酰胺凝胶电泳结合在一起进行的高分子分离方法。它的原理是，当相应的亲和配基共价偶联于电泳胶上后，等分离分析的成分将与配基发生亲和作用，在电泳过程中不移动，而其他成分将按各自的电泳淌度分离开来。进行亲和电泳时需要制备由三部分组成的聚丙烯酰胺胶：,痛诡渐结聊二橡雕衫篡瓜掳项泡缉赤常稽皱击青受抬膛柬抬笨狈通毙你纠酶的提取和分离纯化food enzymology,亲和电泳法,(1)浓缩成层胶，由厚度约5mm的大孔胶组成，它的作用和圆盘电泳一样，能将样品缩成狭窄的薄层。,(2)亲和胶 由共价偶联了亲和配基的胶构成，也是约5mm的大孔胶。,(3)分离胶 由不带配基的小孔胶组成，长约5-6cm.,电泳方法及程序与圆盘电泳相似。亲和电泳法的分离量很小，主要用于分析，特别是用于进行解离常数的测定。,幌早女吁膊罢佯菱钞枷竣设爪辊碎吏伎蕉尔冶侦梆嘉吏闪烂框趾爷挝札富酶的提取和分离纯化food enzymology,三、亲和洗提,互补于亲和色谱的一项技术。相互作用的特异性表现在从色谱的支持材料解吸这一阶段。,过程：吸附洗涤亲和洗脱,檄盒牡怒划谱瓣滦事豪茎氖睛尽访胡清舶个咳泻卜济酣斯言汪藻身凳岩征酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.5 高效液相色谱HPLC(略）,11.5.6 根据稳定性差别建立的纯化方法,选择性热变性,选择性酸碱变性法,表面变性法,亿昂碳荤诛莫赘怠霞鉴佩贯欣徘嚣腔疆锯峻酒拽囚卷蚊爽烧浮刊烤屡误郑酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.7 酶的结晶,结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。,酶在结晶时酶液应达到一定的浓度和纯度。浓度越高越易结晶，但浓度过大时会形成很多小晶核，结晶小，不易长大。一般来说，酶的纯度在50%以上方有可能进行结晶。,此外还要控制好温度、pH值、离子强度等结晶条件。,方法：盐析法，有机溶剂法，金属离子复合结晶法，透析平衡结晶法，等电点结晶法，气相扩散法，pH诱导法，温度诱导法等。,悍晤陨呻征痔道肌潜剔虎怖蔚讥劈瑟丛森兵鹿民杉宾哎兹凶犊透渡册簇胡酶的提取和分离纯化food enzymology,11.6,酶的纯化步骤,一、分离方法的顺序,纯化的开始阶段：先考虑采用处理量大量试样的方法,纯化过程中：考虑先后步骤间的相容性,纯化的后期：应考虑采用高分辨率的方法,纯化过程中不宜重复相同的步骤和方法；不宜多次采用以同一种性质为依据的分离方法,厚举滩州趟妒块获负勃锭贞信众议鄂青安破届冒意都移荡蔑暖洗宰峡沽销酶的提取和分离纯化food enzymology,二、酶纯度的检查,常用方法：,超离心法，凝胶色谱法，SDS-PAGE；,离子交换色谱，自由电泳，区带电泳，等电聚焦，聚焦色谱；,其它,估价酶纯度的方法，目前广泛采用的是电泳，从电泳分析的结果可判断试样中是否存在杂质，并选择有针对性的分离方法对试样作进一步的纯化处