配位化学——锌酶(C9组)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,锌 酶,指导教师 施 展,C9组 田鸿儒 李建明,李 闯 李军旗,陈朋宇,1,耳保择荔文郡镍者烃漂檬病篱福猴心爵笛磕洋寥叼履硷强曾蒜煎樱拳赡撒配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),内容提要：,1 锌酶基本概念,2 碳酸酐酶,3 羧肽酶,4 碱性磷酸酯酶,2,脾授猩豢多台级钮屡柳贼诉瞧闪毋功系皇提卑必危椎垒谜矢这总健鼻嚣扑配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),定义：,含有锌原子的酶类，其中锌原子一般都位于酶的活性部位（包括催化位点和结合位点），其作用是：有的直接参与酶的催化反应，有的则不直接参与，而是起到稳定酶-底物复合中间体结构等作用，前者如碳酸酐酶中的锌，后者如醇脱氢酶中的锌。,性质：,作为辅因子，锌完全以Zn2+形式存在，不同于铜、铁、锰等，无氧化还原能力（d10电子结构），并且具有良好的Lewis酸性和溶解性，杂化方式为sp3，配位数为4，通常形成四面体型配位化合物。,3,吝花摘疥竞永崔肆筑掖薄椽冠粹邵开本蔷绽四贵舆限培尖岭擦郎疟依踪靛配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),表-1 一些常见的锌酶,锌酶,相对分子质量,（,10,3,）,锌原子个数,来源,生物功能,碳酸酐酶,2830,140180,1,6,哺乳动物红细胞,植物,CO,2,的可逆水合,羧肽酶,3436,1,哺乳动物胰脏,肽链C-末端氨基酸的水解,氨肽酶,300,46,猪肾,肽链N-末端氨基酸的水解,碱性磷酸酯酶,89,4,大肠杆菌,磷酸单酯的水解,醇脱氢酶,8,4,马肝,氧化醇成为醛,4,与混材寇幌庄刺甲采窥坟扁员伍寐控桶巍炬腮混米竟绩液徽翰沤钨贼熔爹配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组), 碳酸酐酶,1933年发现，能够催化CO2的可逆水合，因而被命名为碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA），1940年确定其中含有Zn2+，并且证明Zn2+在该酶的催化过程中不可缺少，广泛存在于绝大多数生物体内，催化的反应为,CO2 + H2O HCO3- + H+,酶存在，pH=9，25条件下，反应速率约为106M/s；无酶时同条件下只有7.010-4M/s。由此可见，碳酸酐酶中的Zn2+在催化CO2水合的反应中起到的不可替代的作用。,5,雌励私箍惺逝乘捷裔拥愁秸赏圭彦竭收蔓雅恐柄晚暖妇汗宾枉一豺嫉餐茅配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),图-1 碳酸酐酶及活性部位Zn2+周围的结构,（a）碳酸酐酶,（b）活性部位Zn2+周围的结构,6,待陀琢刑豢番逞蔽瑚米松真瞬渣潮闹罗逃肋锦伦惹湾赣杨之遵苦炳央嘛揩配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),Zn2+催化CO2水合的作用原理：,研究方法与手段：,锌酶一般为无色，难以用谱学方法对其深入研究。采用化学方法将天然碳酸酐酶中的Zn2+用Co2+取代，因为四配位高自旋的Co2+有与天然碳酸酐酶中Zn2+相似的扭曲四面体的配位构型，而电子构型为d7的Co2+有较为丰富的谱学性质。具体做法是先用化学方法除去天然碳酸酐酶中的Zn2+得到脱辅基蛋白（apo-protein），后者再与Co2+结合得到Co2+取代的碳酸酐酶Co2+-CA。,碳酸酐酶CA 脱辅基蛋白（apo-protein）,Co2+-CA,-Zn2+,+Co2+,7,汹嗜邢操亲惮杏作桌倒姑侵氦蒙性邻沸黔酬土瘟魄匣倚绑蝎双邮报蛾棕希配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),然后通过测定在不同pH值下Co2+-CA的紫外可见光谱，推测不同pH值下Co2+的配位环境及配位物种等。结果显示，在低pH值（酸性）时， Co2+趋向于五配位； pH值逐渐增高，碱性增强时就会失去1个配位H2O， Co2+变为四配位；pH值再高时，与Co2+配位的另一个H2O也会失去一个H+，从而形成Co2+-OH-。失去H+时的pH值的大小反映了与Co2+配位的H2O的pKa的大小。该过程可用图-2表示如下：,8,笛越振映伸皿邪淆洱六涂冤券逮鳃疆朴汗局漂棕敏娶沈徊娶佛活秋穗汪凄配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),图-2 Co2+-CA中Co2+的配位环境及物种随pH值的变化,9,侣己砸荣阑肢眩沦姆躺娇咒股室娱廓膘凉四骤脾撒硬子鲸恍樊江控蓖药梯配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),由以上推测，天然碳酸酐酶催化CO2可逆水合反应的活性物种为Zn2+-OH-。现已证明，天然碳酸酐酶中与Zn2+配位的H2O的pKa约为7，即在几乎中性条件下即可发生Zn2+-OH2 Zn2+-OH-+H+，也就是说，由于Zn2+的参与大大降低了配位H2O的pKa。,结论：,碳酸酐酶催化CO2可逆水合的反应过程是，首先活性物种Zn2+-OH-进攻CO2中的碳原子形成如图3所示的中间体，之后脱去HCO3-，同时Zn2+再结合一个H2O，从而完成一个催化循环。,10,玉菠谴原机揖踏薛莲鹅悯睁陆要轿晕见保代织动付护缆嘻辩增饵瞻羌届响配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),图-3 天然碳酸酐酶催化CO2可逆水合反应的反应中间体,11,蹦拌办瘴耽衫蒜热有侥怜破笑贷距忻厩孵边晋痹弱活欢暖里缕觉汹怔听刺配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组), 羧肽酶,生物体系中催化肽链水解的酶主要有两类：催化肽链C-末端氨基酸水解的羧肽酶（carboxypeptidase，CP）和催化肽链N-末端氨基酸水解的氨肽酶（aminopeptidase）。其中羧肽酶催化的反应如下：,R-CO-NH-CHR-CO2- + H2O,R-CO2- + H3N+-CHR-CO2-,如果R基团含有芳香基团，则称选择性水解这类反应的羧肽酶为羧肽酶A（CP-A）；如果R基团为碱性基团，则称之为羧肽酶B（CP-B）。,12,腹趾匿康杜觉胚待误赖糊喳不橙唐攻廉刷遥添尾失碧疆柠凤契范尽阜升蔫配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),其中来自牛胰腺的羧肽酶A研究得比较清楚，其蛋白链有307个氨基酸组成，并且有一个单核Zn2+的活性部位，其中Zn2+为五配位，2个氮原子来自蛋白链中组氨酸（His）残基，另外谷氨酸（Glu）残基侧链的羧酸根以双齿形式与Zn2+配位，除此之外还有1个配位H2O。,13,稻缕砖靛囤篓硷再争早溉糜仗署刑逢琐枣佐肚刑竖连砸弛尖茶棋养卵良糟配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),14,图-4 牛胰腺羧肽酶A及活性部位Zn2+周围的结构,（a）牛胰腺羧肽酶A,（b）活性部位Zn2+周围的结构,拎壳员叁涡真我愁怒未锻眺匠驭棉忠弃蔫萄撒熬照秧谆衍谆陪弃治蹭涸默配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),比较碳酸酐酶和牛胰腺羧肽酶A的结构可以看出两者结构不同，其中包括蛋白链结构和活性部位Zn2+周围结构的不同，导致二者具有完全不同的功能。,在牛胰腺羧肽酶A的活性部位，除了有1个Zn2+催化的反应中心外，还有1个较大的疏水口袋（hydrophobic pocket），从而有利于C-末端为含芳香基残基的肽链（底物分子）选择性地结合到催化反应活性中心。,另外，与Zn2+配位的H2O可直接进攻肽链，一方面是由于Zn2+的参与大大降低了配位H2O的pKa，另一方面活性部位附近的另1个未与Zn2+配位的Glu残基在催化过程中也起着非常重要的作用。,15,牌缝袄常硼凤虐骋岗葛枢嘴恐蟹卖商许叭杀恍批吴匿离恳霓竭榴览朗鸟禽配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组), 碱性磷酸酯酶,上面介绍的碳酸酐酶和羧肽酶A都是单核金属酶，而碱性磷酸酯酶（alkaline phophatase，AP）则是双核金属水解酶，广泛存在于各种生物体中，它的生物功能主要是催化磷酸单酯水解生成醇或酚和游离的磷酸根离子：,E + RO-PO32- ERO-PO32- ,E-PO32- E + HPO32-,正如其名称中所反映的一样，该酶在碱性条件下催化活性最佳，最适pH值约为8。,- RO-,H2O,16,锋卞掂预间间越结盯吟魁诞景凹像纵经瞄蒜输商节惧知奏谎综捍若军授核配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),从大肠杆菌中分离得到的碱性磷酸酯酶（E.coli AP）的相对分子质量约为94103 ，是由2个亚基组成的二聚体，每个亚基包含2个Zn2+和1个Mg2+。 2个Zn2+之间的距离约为0.4nm，而Mg2+距离双核锌活性部位约0.50.7nm。,（a）E.coli AP的结构,（b）活性部位结构,17,图-5 E.coli AP的X衍射晶体结构及活性部位结构,蛙鹃兄咨井祸裳陷各沪仆虽一鹅洁并隔愉静簧填恶韭篇炽捂即庸蛰砸砍脆配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),从图中我们可以看出，2个Zn2+的配位环境是不同的，2个Zn2+通过磷酸根离子的2个O原子桥联在一起。而在天然碱性磷酸酶中，2个Zn2+之间没有桥联基团磷酸根离子。其中磷酸根离子中与Zn12+配位的O原子被1个H2O占据，而与Zn22+配位的O原子的位置则被丝氨酸（Ser102）残基侧链上的O原子所占据。正是由于Ser102的O原子与Zn22+之间有配位作用，使得Ser102残基侧链中的-OH的pKa下降至约7.0。也就是说在略偏碱性的条件下，与Zn22+配位的-OH即可失去质子生成亲核进攻活性基团锌-烷氧基负离子（Zn-alkoxide）。,18,郴嚏扫虎锐芥硷狙抬誊钥塔摆五婚币掏唯身垄凌刺耶斋慌欣梦翔卿微荚宛配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),金属离子取代实验表明， Zn2+对酶的活性是必需的。例如用Co2+取代Zn2+ ，酶的催化活性只有原来的30%，而用Cd2+或Mn2+取代Zn2+之后，反应活性则要降低得更多。这些差别可能是由Zn2+、Co2+、Cd2+、Mn2+等金属离子的Lewis酸性不同，以及它们与底物分子、反应中间体等物种的结合能力不同等因素造成的。而酶中的Mg2+主要起到稳定结构的作用，对催化活性没有太大的影响。,目前推测的碱性磷酸酯酶催化磷酸单酯水解的可能机理如图-6所示：,19,许别埠遇氢府阜瘩兽刘帚钡恕明菜腆惫搔椽并孽碗慧帕囚捷达荧雾鼎销旬配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),图-6 碱性磷酸酯酶催化磷酸单酯水解的可能机理,20,捉殆铅椭壬咖指乍庐奖揣铣恳唤筑拐藏宣馁斡店编另狄舀禽舌宾坯僻问融配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),该反应分为两步：,第一步是锌-烷氧基负离子进攻酶-底物结合形成的复合物（ERO-PO32-）中的P原子，并在Zn12+的作用下削弱与其配位的O和P之间的键，从而使RO-离去，并形成磷酯-丝氨酸中间体，磷酸酯水解完成第一步。,第二步由配位于Zn12+上的H2O脱去质子形成的亲核基团锌-羟基负离子（Zn-hydroxide）进攻磷酯-丝氨酸中间体，导致磷酯-丝氨酸之间的O-P键断裂，从而生成无机磷酸根离子，完成第二步水解。,21,割芭咙岂侩笨豹巫胯硫控张捧镭贬吴度纶翔臭逆猴射邮洱恕扮岗盂延泣锈配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),为进一步证实丝氨酸的亲核进攻作用，有人用基因定点突变的方法用亮氨酸（Leu）或丙氨酸（Ala）取代丝氨酸（Ser102），结果发现催化反应活性降低了很多，表明Ser102在催化反应过程中起着重要作用。,另外，从图-6也可以看出，精氨酸（Arg166）在底物分子与酶的结合以及在稳定反应中间体等方面也起着重要作用。,22,翱囤僧馅擞睫姜惋褒捆族巳蛤瘫照皆照锌乒校辅酵勒弘誉淖歧斯社篱蕾爽配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),The end,Thank you for attention!,23,鸽完蝗昏放吟恋拜趋圾辫装艺遂窑融看嘿严奶嚏堪蚤腥烷断艰呈性藻屯援配位化学锌酶(C9组)配位化学锌酶(C9组),