月季花药培养

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,课题背景,1,、,1964,年印度科学家首次培养毛叶曼陀罗花药，由花粉粒发育获得单倍体植株：,说明,：,2,、自,20,世纪,60,年代以来，花药培养的研究迅速发展，据记载已有,250,多种高等植物的花药培养获得成功，,近,50,多种花粉再生植株由我国科技人员首先培育成,功。,生殖细胞在离体条件下也具有发育全能性。,知识回顾,单倍体育种的过,程,：,花药离体培养（,N,）,单倍体植株（,N,）,秋水仙素处理，使染色体翻倍,植株（,2N,）,特点：,1,明显缩短育种年限,2,后代植株都为纯合子。,正常植株（,2N,）,植物的花药培养在育种上有什么意义？,课题,2,月季的花药培养,被,子植物花的作用,被子植物的,有性生殖,是在,花,里进行的，,雌蕊和雄蕊,是进行,有性生殖的主要部分,课题内容：,（一）基础知识,（二）实验操作,（三）结果与分析,花的结构,花托,花萼,花瓣,雄蕊,花药,花丝,雌蕊,柱头,花柱,子房,花丝,花药：,囊状结构，内有很多花粉,（一）被子植物的花粉发育,1,雄蕊,一、基础知识,花粉囊,大多数被子植物的花药是由,4,个花粉囊（少数植物为,2,个）组成，分为左、右两半，中间由药隔相连。,当,花粉囊的壁组织逐步发育分化时，会形成大量的,花粉母细胞（小孢子母细胞,）。,2.,花粉的概念,花粉粒是由,花粉母细胞,经过,减数分裂,而形成，因此，花粉粒是,单倍体的生殖细胞,。,被子植物花粉的发育要经历：,四分体时期、单核期和双核期,等阶段。,小孢子母细胞,（花粉母细胞）,减数分裂,4,个小孢子,（,4,个单倍体细胞连在一起，小,孢子四分体时期）,1,个小孢子,（,单核居中期）,：这时的细胞含有,浓,厚的原生质,，核位于细胞中央称为单核居中期,3.,花,粉,发育过程：,进,入单核期,（四分体的,4,个单倍体细胞彼此分离，各自形成具,有单,细胞核的花粉粒）,有丝分裂,1,个小孢子,（,单核靠边期）,：随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧称为单核靠边期,花粉管细胞核,生殖细胞核,营养细胞,生殖细胞,有丝,分裂,2,个精子,（基因型相同）,双核期,两个精子和一个营养核的基因型相同,生殖细胞核与花粉管细胞核基因型相同；,注意,：,二核花粉粒,：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）,三核花粉粒：,有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个花粉管细胞核和两个精子,。,思考：,1.,被子植物花粉发育过程中的四分体时期与减数分裂过程中的四分体时期是同一阶段吗？,2.,花粉粒中几个细胞核的基因型相同吗？,减数分裂,有丝分裂,四分体时期,单核期,双核期,1,个花粉母细胞,4,个小孢子,减数分裂,有丝分裂,4,个花粉管细胞,核,4,个生殖细胞核,8,个精,子,有丝分裂,（基因型不一定相同）,（基因型不一定相同）,A.,花粉是花粉母细胞经有丝分裂形成的,B.,花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期,C.,花粉发育经历的四分体时期与减数分裂的四分体时期含义相同,D.,花粉母细胞形成花粉粒中精子的过程是一系列减数分裂的过程,1.,下列关于被子植物花粉的形成，说法正确的是,B,2.,下列关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是,A.,被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果,B.,花粉粒是在花妖中的花粉囊中形成的,C.,花粉粒在发育过程中，核先位于细胞中央，在移到细胞的一侧,D.,被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段,A,（二）产生花粉植株的两种途径,移栽,花药中的花粉,胚状体,脱分化,愈伤组织,花药中的花粉,脱分化,分化,丛芽,再分化,丛芽,诱导,生根,快速阅读,P38,页有哪两种途径？原因是什么？,1,形成原因：主要取决于培养基中,种类及其浓度配比。,2,植株的特点：,植株，植株弱小，,。,激素,单倍体,高度不育,资料,胚状体：,又称,体细胞胚,，这种体细胞在形态上能够转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，而且他的发育过程也与合子胚类似，胚芽、胚根、胚轴等结构完整，就像一颗种子。,1.,为什么,胚状体,和,愈伤组织,到丛芽分别称为,分化,和,再分化,？,思 考,2.,花粉植株弱小，高度不育，是否就没有利用价值？,用于单倍体育种技术，可明显缩短育种周期，培育纯合新品种。,胚状体就像种子，有胚芽、胚轴、胚根等结构。胚状体到丛芽就是由原始的分化状态继续生长和分化完成的。,而愈伤组织形成丛芽的过程是从脱分化状态进入再分化形成丛芽的过程。,3.,下列对产生花粉植株途径的叙述，不正确的是,A.,花粉通过胚状体阶段直接发育成植株,B.,花粉先形成愈伤组织在诱导分化成植株,C.,花粉经脱分化形成胚状体，在分化出根，然后诱导生芽,D.,两种途径并无绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类和浓度比例,C,部分花药通过胚状体途径形成小植株,烟草花药培养,胚状体发育途径,愈伤组织转接种到再生培养基,愈伤组织分化形成再生植株,水稻花药培养,愈伤组织发育途径,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,（三）影响花药培养的因素,1,、材料的选择,（,1,）同,一植物的不同生理状况,（花期早期初花期）,花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般月季的花药培养时间选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。,（,2,）合,适的花粉发育期,（单核居中期与靠边期之间）,选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。,为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未,开 放,的花蕾。,注意：选择最合适的花粉发育时期,:,单核期,不选择单核期之前花药原因：,花药质地幼嫩，容易破碎,；,不选择单核期之后花药原因：,花瓣开始松动，给材料消毒带来困,难,；,盛开的或略微开放的花都不易选做实验材料,月季,答：花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。,思考,为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？,2,、培养基的组成：,培养基的组成会影响脱分化与再分化,花,药培养基可能因植物的不同而有所变化如,小麦中为,N6,马铃薯、月季中为,MS,油菜中为,B5,培养基,月季花药培养基配方,：在,1000mlMS,培养基配方中添加,2,4,D(0.4mg),、,KT(0.2mg),、,IAA(4mg),；调节,PH,至,5.8,如,亲本的生长条件,、,材料的低温预处理,以及,接种密度,对诱导成功率都有影响。,培养基各成分中，,植物生长调节剂的水平和配比,，常对诱导细胞的分裂、生长和分化起决定作用。,3,、其他影响因素：,通常从生长旺盛的植株上取早期现蕾的花药或花粉进行培养，较易形成花粉植株；取蕾前，供体植株的栽培条件的好坏也影响花粉植株的诱导率。,A,亲本植株的生长条件,其他影响因素：,有报道称低温（如,4,）预处理一定时间（如,48 h,）可以明显促进胚状体的形成，有的经短期高温（,30 40,）处理也能够促进胚状体的形成，但是不同作物对所需的最适处理温度和时间要求不同。,B,材料的低温预处理,C,培养条件,培养温度通常保持在,25,左右，光照因作物种类不同而异。在花粉培养的早期，黑暗或弱光条件可能更有利于花粉分裂的启动。,D,接种密度,三、,实验操作,（,一）材料的选取,（二）材料的消毒,（三）接种和培养,（一）材料选取,2,、通过,镜检,来确定是否处于适宜的发育期。,方,法：,醋酸洋红法,(,将染色体染成红色,),1,从,花药看,：月季的初花期,从花粉看：,单核期,从花蕾看,：完全未开放的,花药（载玻片上）,1%,的醋酸洋红,1,滴用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）,花药（在卡诺氏固定液中处理,20min,）取出，置于载玻片上,焙花青铬矾溶液染色,盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）,焙花青,-,铬矾法,(,花粉细胞核染成蓝黑色,),。,4.,用醋酸洋红法确定花粉发育时期的原理是,A.,醋酸洋红可使细胞全部着色,B.,醋酸洋红可使单核期的细胞着色,C.,醋酸洋红可使花粉细胞核着色,D.,醋酸洋红可进入细胞显示放射性标记,C,（二）材料的消毒,（无菌吸水纸）,吸干水分,（,0.1,氯化汞溶液）,2,4min,（无菌水）,冲洗,花蕾,（,70,酒精）,大约,30s,（无菌水）,清洗,与菊花外植体的消毒相比较，有何不同？为什么？,在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗。,因为月季花蕾,外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。,（质量分数为,1%,的,次氯酸钙溶液,或饱和漂白粉溶液）,1,、剥取花药,:,灭菌后的花蕾，,在无菌条件下除去萼片和花,瓣，用,镊子取出花药,2,、接种,:,立即将花药接种于培养基上，通常每瓶,接种,花药,7-10,个,。,注意：,勿损伤花药,：,要彻底去除花丝,：,（三）接种和培养,以免诱导出非花粉愈伤组织,因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成,一,般经过,20-30,天,培养后，会发现,花药开裂,，,长出愈伤组织,或,释放出胚状体。,3,、培养,如长出愈伤组织：,则将,愈伤组织,及时,转移到分化培养,基,上，以便进一步,分化出再生植株。,如果花药开裂释放出胚状体：,则一个花药内就会产生,大,量幼小植株，,必须在花药开裂后尽快将,幼小植株,分,开，,分别移植到新的培养基上，否则这些植株将,很,难分开。,25,左右；,不需要光照，,小植株形成后光照。,培养条件：温度：,光照：,4,、鉴定和筛选：,在,花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株,，常,出现,染色体数目倍性,的变,化,（主,要原因是营养核和生殖核融合造成的）,诱导丛芽或胚状体培养基配方：,MS,培养基中加,GA(0.1mg/L),IBA(0.5mg/L),和,(1mg/L);,诱导生根培养基配方：,MS,培养基各成分用量减半，添加,IAA(1.5mg/L),四、结果分析与评价,1,、选材是否恰当,选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。,2,、无菌技术是否过关,如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。,3,、接种是否成功,如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。,基础知识,实验操作,被子植物的花粉发育,花粉,其他因素,影响因素,花粉发育经历的时期,月季的花药培养,材料与培养基,材料的选取,产生途径,结果分析与评价,消毒,接种和培养,课堂小结,答：,F2,代紫色甜玉米的基因型组成可能为,Aasusu,或,AAsusu,。如果运用常规育种方法，将,F2,代中的紫色甜玉米与白色甜玉米（,aasusu,）进行测交，可以选择出基因型为,AAsusu,纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和育种时间。如果利用花药培养的技术，在,F1,代产生的花粉中就可能有,Asu,的组合，再将花粉植株进行染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体（,AAsusu,）。这种方法可以大大缩短育种周期。,课后练习：,P40,1,、紫色、不甜玉米（基因型为,AASuSu,）和白色、甜玉米（基因型为,aasusu,）杂交（,Su,和,su,代表一对等位基因），得到,F1,（,AaSusu,）再进行自交，,F2,会有紫色甜玉米的表型产生，如运用常规育种方法，应如何筛选出纯和紫色甜玉米？（运用单倍体育种呢？）,二者都是快速、大量繁殖花卉的技术手段。,菊花茎的组织培养,月季花药培养,不,同,点,外植体细胞类型,外植体为体细胞,取材为花药，是生殖细胞,培养结果,正常植株,单倍体幼苗,，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使,染色体加倍,，,恢复,正常植株的,染色体数,