结构生物学导论课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,电子云密度和结构解析,F (,hkl,),= V, (x,y,z) exp 2i (hx+ky+lz)dxdydz,x=0 y=0 z=0,1 1 1,电子密度函数, ,(xyz) =,（,1/v,）,F,hkl,exp-2,i (hx+ky+lz),h k l,F,hkl,= | F,hkl,| exp (i,hkl,),Fourier,加和,采用用快速,Fourier,变换技术,通常在三维晶胞中按,d,min,/3,的格点进行计算,分析电子密度图 二级、三级、四级结构,结构模型，原子坐标,(,不包括,H,原子,),0,0,y,x,0.05,0.05,(x,y,z) = (0.05,0.05,0),32,45,30,48,69,47,29,49,32,31,28,解决相位问题的方法,差值,Fourier,法,与已知结构差别很小且同晶,分子置换法 （,MR),有已知相似结构而不同晶,独立位相：单波长反常散射法,(SAD),；多波长反常散射法（,MAD),，多对同晶置换法（,MIR,）,无已知相似结构,直接法,差值,Fourier,法,适用于未知结构与已知结构差别很小且同晶时,（如定点突变体、蛋白与小分子的复合物,),(xyz)=(1/v),(,F,未知,-F,已知,),exp-2,i (hx+ky+lz)+i,已知,h k l,未知结构与已知结构的差异,+,缺少原子，,-,多余原子 调整模型,-,多余原子,衍射数据 已知结构,|Fo,未知,| - |Fc,已知,|,已知结构,P,(xyz),F,=, f,j,exp 2i (hx,j,+ky,j,+lz,j,) = |F| exp (i),Step 1,temp.sca,temp.mtz,CCP4,程序包中的,scalepacktomtz,程序,Step 2,temp.mtz,temp-freeflag.mtz,CCP4,程序包中的,freeflags,程序,Step 3,phenix.refine known.pdb temp-freeflag.mtz,Step 4,Coot,程序,电子密度图和修正后的原子坐标文件,分子置换法,Molecular replacement (MR),适用于有不同晶的已知相似结构时,如同源蛋白、同一蛋白的不同晶型,程序,: Phaser, MolRep, Amore, CNS,等,分子置换法相角解析原理,最符合未知,结构的,|Fo|,的,搜索模型分子,方位和位置,已知结构,搜索模型分子,|Fc|,未知结构,衍射数据,|Fo|,旋转函数,平移函数,(xyz),未知结构的初始结构模型,P,氨基酸序列替换,Six-dimensional search,Place the reference molecule successively at each of the points on a fine grid,sampling the asymmetric unit of the target crystal unit cell.,At each test position, place the reference molecule into all possible orientations,again using a fine grid, creating a set of poses.,For each pose, generate the symmetry mates of the reference molecule. This,produces a possible model for the crystal of the target molecule.,Calculate,F,R,(h) for each potential model, and compare it with,F,T,(h).,R =, |,F,R,(h) ,F,T,(h) | / F,T,(h),h,h,P(uvw)=,（,1/v,）,|F,hkl,|,2,exp-2,i (hu+kv+lw),h k l,P(uvw) =,(x,y,z)(x+u,y+v,z+w),unit cell,交叉旋转函数,P(uvw)=,（,1/v,）,|F,hkl,|,2,exp-2,i (hu+kv+lw),h k l,分子内部的原子间矢量,自身,Patterson,峰,自身,Patterson,峰分布在围绕原点,半径为相当于分子尺,度的一个体积内,R(C) =P,1,(X) P,M,(CX) dV,(,C,为旋转矩阵,),交叉,旋转函数,|Fo,(,未知,),|,|Fc,(,已知,),|,当模型分子旋转到与未知分子方位一致时, P,1,与,P,M,达到,最大重叠,R(C),极大,相应的旋转角就是旋转函数的解,平移函数,t,为平移矢量,(,三个分量,), ,Fc,(,已知）,Fo,(,未知,),搜索模型分子,1,2,间的,交叉,Patterson,函数,分子间的原子间矢量,交叉,Patterson,峰,当旋转后的模型分子平移到与未知分子位置一致时,P,1,2,(U,T),与,P(U),达到最大重叠,T(t),极大,相应的平移矢量就是平移函数的解,:,Tx, Ty, Tz,输入旋转函数的可能正确的几个解,计算平移函数,用未知分子和搜索模型分子的结构振幅之间的关联系数作为判据,选取平移函数的解,(,正确解的关联系数通常明显高于其他解,有时也可能不是最高,),搜索模型分子的选择,选择与未知结构相似的已知结构作为搜索模型分子,搜索模型分子可以是一个分子,一个寡聚体,一个亚基,一个结构域,搜索模型分子中,与未知结构相同的残基保留侧链,不同残基改为,Ala(,对应于未知分子的,Gly,的氨基酸残基可改为,Gly),搜索模型分子与未知结构进行序列比对,搜索模型分子相对于未知结构的插入残基可删去,刚体修正和初始相角的计算,把旋转和平移后的分子作为刚体进行微调,对, ,Tx, Ty, Tz,进行精修,关联系数提高,把搜索模型分子按精修后的, ,Tx, Ty, Tz,进行旋转和,平移,置于未知晶胞中,初始相角,R,因子和,电子密度,检验,:,产生未知晶胞中的全部分子,相互间应无重叠,所得初始相角与,|Fo|,结合,计算,3,分辨率,初始电子密度,主链应,与模型基本吻合,计算,3,分辨率的,R,因子，通常为,0.4-0.5,R= |Fo|-|Fc| / |Fo|, ,观测值,计算值,初始模型的建立,按未知结构的序列进行氨基酸残基替换,精修一轮,(3,分辨率,),R,因子降低,电子密度改进,基于电子密度,建立初始模型,phaser eof,MODE MR_AUTO,HKLIn test_cad.mtz,LABIn F=FP SIGF=SIGFP,ENSEmble mol PDB min.pdb IDENtity .99,COMPosition PROTein MW 20000 NUM 2 #ck2a,SEARch ENSEmble mol NUM 2,ROOT final # not the default,END,eof,Phaser,程序,input file,Step 1,temp.sca,temp.mtz,CCP4,程序包中的,scalepacktomtz,程序,Step 2,temp.mtz,Solve.pdb,Phaser,程序,Step,4,phenix.refine,solve.,pdb,temp-,freeflag.mtz,Step,5,Coot,程序,电子密度图和修正后的原子坐标文件,Model.pdb,Step,3,temp.mtz,temp-freeflag.mtz,CCP4,程序包中的,freeflags,程序,多对同晶置换法,Multiple-isomorphous replacement,（,M I R),制备至少两个,同晶,的重原子衍生物,与母体空间群相同,晶胞参数只有微小的差别（,0.5-1%),除了在某些位置上增加了重原子外，其他对应的原子位置都相同（不扰乱蛋白分子的构象和晶格堆积）,重原子浸泡,用,浸泡法,制备重原子衍生物,实践,浸泡液组成与晶体生长的槽液相似，含重原子试剂,重原子试剂的,种类,:,如,K,2,PtCl,4,(Cl,CN, NO3), Pt(NH,3,),2,Cl,2, K,2,AuCl,4,(Cl,CN, NO,2,) (,主要与,Met,结合,),Hg(OAc),2,(OAc,Cl) ,有机汞化合物,(,主要与,Cys,结合,),Na,3,IrCl,6,(Na,K, NH,4,) (,主要与,Lys,结合,温和,溶解度高,可用到,100mM),UO,2,(NO,3,), (NO,3,OAc),稀土元素等,浓度,（常用,0.1-10 mM,，可分步浸泡以减少对晶格的破坏）,浸泡,时间,（,hrs-days),(,首次实验可试,1mM,1,天,),要求：,同晶度好,结合位点少,占有率高,差值,Patterson,函数,生物大分子,: Patterson,函数不能直接反映重原子位置,母体衍射数据,I,P, |F,P,|,重原子衍生物衍射数据,I,PH, |F,PH,|,计算,差值,Patterson,函数,，解出重原子位置,P(uvw)=,（,1/v,）,(,|F,PH,|- |F,P,|),2,exp-2,i (hu+kv+lw),h k l,差值,Patterson,峰代表,重原子间矢量,重原子位置,计算,F,H,重原子位置的精修（如用最小二乘法）,计算,重原子对结构因子的贡献,F,H,N,F(hkl)=Kq,j,f,j,exp2,i (hx,j,+ky,j,+lz,j,)-B,j,(Sin,/,),2,j=1,只对重原子加和,F,H,H,矢量三角形,F,PH,= F,P,+ F,H,复数加和,(,矢量加和,),至少用两个重原子衍生物才可唯一确定相角,已知,|F,P,| |F,PH,| F,H,多对同晶置换相角解析步骤,1.,生长母体晶体,2.,采集母体衍射数据,(,包括初步晶体学研究,),3.,制备重原子衍生物, X-,衍射实验初步鉴定晶体衍射情况,4 .,初步采集重原子衍生物数据,5.,衍射数据分析,(,计算同晶差值,|F|iso,初步判断重原子衍生物是否合用,),6.,改进重原子衍生物,重复,3-5,7.,找到合用的重原子衍生物后，采集重原子衍生物的精确衍射数据,(,包含反常散射数据,),7.,求解相角,(,包括差值,Patterson,计算和分析,重原子位置精修,搜寻次要位置，原点统一,手性确定,),8.,电子密度改善和解释,获得部分结构信息,单波长反常散射法,Single wavelength anomalous dispersive method(SAD),Friedels law,F,h,= F,h,(cos, + isin ) = A + iB,F,-h,= F,-h,cos(-,) + isin(-) = A - iB,I,h,F,h,2,=(A + iB)(A+iB) = A,2,+B,2,I,-h,F,-h,2,=(A - iB)(A-iB) = A,2,+B,2,h,= -,-h,F,h,F,-h,h,-h,Breakdown of Friedels law,f,j,= f,0,+,f + i f,SIRAS phasing,SAD phasing,单波长反常散射相角解析步骤,1.,生长母体晶体,2.,采集母体衍射数据,(,包括初步晶体学研究,),3.,制备重原子衍生物, X-,衍射实验初步鉴定晶体衍射情况,制备硒代蛋白质晶体。,4 .,初步采集重原子衍生物数据,5.,衍射数据分析,(,计算同晶差值,|F|iso,初步判断重原子衍生物是否合用,),6.,改进重原子衍生物,重复,3-5,7.,找到合用的重原子衍生物后。,8.,采集重原子衍生物的精确衍射数据,(,包含反常散射数据,),9.,求解相角,(,包括差值,Patterson,计算和分析,重原子位置精修,搜寻次要位置，原点统一,手性确定,),10.,电子密度改善和解释,获得部分结构信息,Step 1,temp.sca,重原子坐标,hkl2map,程序,Step 2,temp,.sca,Resolve_1.mtz,Solve in,Phenix,Step,4,phenix.refine,start.,pdb,resolve_1.,mtz,Step,5,Coot,程序,电子密度图和修正后的原子坐标文件,Step,3,Resolve_1.,mtz,Start.pdb,Resolve in,Phenix,重原子坐标,Protein.seq,