DNA的合成课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA的合成,DNA-,遗传信息的载体,蛋白质,-,生物性状的体现者,?,中心法则,以亲代,DNA,为模板合成子代,DNA,、从而将遗传信息准确地传递到子代,DNA,分子的过程。,1. DNA,的复制,传递遗传信息,2.,转录,表达遗传信息,生物体以,DNA,为模板合成,RNA,的过程 。,3.,翻译,表达遗传信息,mRNA,分子中由碱基序列组成的遗传信息，通过遗传密码破译的方式转变成为蛋白质中的氨基酸排列顺序。,传统中心法则,4. RNA,复制,1965,年，科学家在,RNA,肿瘤病毒中发现了一种,RNA,复制酶，它可以对,RNA,进行复制。,RNA,复制,病毒,RNA,进入宿主细胞后，还可进行复制，即在,RNA,指导的,RNA,聚合酶催化进行,RNA,合成反应。,逆转录,在逆转录酶的催化下，以,RNA,为模板合成,DNA,的过程，又称反转录。,1970,年，科学家在致癌的,RNA,病毒中发现了逆转录酶，它能以,RNA,为模板合成,DNA.,5.,逆转录,中,心,法,则,DNA,DNA,DNA,复制,遗传信息,DNA,RNA,逆转录,遗传信息,RNA,RNA,RNA,复制,遗传信息,DNA,mRNA,转录,遗传信息,mRNA,蛋白质,翻译,遗传信息,DNA,的生物合成,RNA,的生物合成,蛋白质的生物合成,第十一章,DNA,的生物合成,(,复制,),DNA Biosynthesis (Replication),目的要求,1.,掌握,半保留复制概念，原核生物参与复制中酶、蛋白质因子的种类和作用。,2.,熟悉,逆转录概念，逆转录酶活性特点；,DNA,损伤修复方式。,3.了解 复制过程；真核生物DNA复制的特点；突变类型。端粒与端粒酶作用。,内容,第一节,复制的基本规律,第二节,复制的酶学,第三节,DNA,生物合成过程,第四节 逆转录,第五节,DNA,损伤与修复,复制的基本规律,Basic Rules of DNA Replication,第一节,复制,(replication),是指遗传物质的传代，以母链,DNA,为模板合成子链,DNA,的过程。,复制,亲代,DNA,子代,DNA,半保留复制,(semi-conservative replication),双向复制,(bidirectional replication),半不连续复制,(semi-discontinuous replication),DNA,复制的特征,一、半保留复制的实验依据和意义,1.,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 分散式,2.,半保留复制证据,1958,年,Messelson,和,Stahl,DNA,生物合成时，母链,DNA,解开为两股单链，各自作为模板,(template),按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的,DNA,，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的,DNA,都和亲代,DNA,碱基序列一致。这种复制方式称为,半保留复制,。,3.,半保留复制的概念,按半保留复制方式，子代,DNA,与亲代,DNA,的,碱基序列一致,，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的,保守性。,4.,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但,不是绝对的,。,1,、,复制起点,(origin),：,DNA,解链和复制从特定序列的位点开始。,2.,复制子,(replicon),：,从一个复制起点启动复制的全部,DNA,序列。原核生物：单复制子，真核生物：多复制子,3.,复制叉,(replication fork),：,解链点形成分叉结构，（单向、双向）,4.,双向复制,：复制时，,DNA,从起始点向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉。,二、双向复制,A.,环状双链,DNA,及复制起始点,B.,复制中的两个复制叉,C.,复制接近终止点,(termination, ter),ori,ter,A B C,真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉,真核生物的多复制子复制电镜图,参与,DNA,复制的物质,底物,(,substrate,),:,d,ATP, dGTP, dCTP, dTTP,聚合酶,(polymerase):,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶，简写为,DNA-pol,模板,(template) :,解开成单链的,DNA,母链,引物,(primer):,提供,3,-OH,末端使,dNTP,可以依次聚合,其他的酶和蛋白质因子：,拓扑异构酶、解螺旋酶、单链,DNA,结合蛋白、引物酶、连接酶,DNA,复制的酶学,The Enzymology of DNA Replication,第二节,1.,解螺旋酶,(,helicase),又称解链酶或,rep,蛋白,利用,ATP,供能，作用于氢键，使,DNA,双链,解开成为两条,单链,。,每解开一对碱基，需消耗,2,分子,ATP,。,Dna B,Dna C,解链方向,2.,单链,DNA,结合蛋白,(single stranded DNA binding protein, SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。,3.DNA,拓扑异构酶,(DNA topoisomerase),10,8,局部解链后,拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。,解链过程中，,DNA,分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,作用机制,拓扑异构酶,切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。（主要）,4.,引物酶,(primase),依赖,DNA,的,RNA,聚合酶,。,对利福平不敏感。,可以催化,游离,NTP,聚合。,在大肠杆菌，是,dna,G,基因的表达产物。,催化,RNA,引物的生成。,引物（,primer,）：,是由引物酶催化生成的短链,RNA,，它可为,DNA,聚合提供,3-OH,末端。,U,引物,RNA,5,3,OH,原料：,NTP,合成方向：,5 3,合成位点：,Ori,模板：亲代单链,DNA,5. DNA,聚合酶,全称：,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,(DNA-dependent DNA polymerase),简称：,DNA-pol,活性：,1,.,5,3,的聚合活性,2.,核酸外切酶活性,5,3,OH,作用：合成,DNA,原料：,d,NTP,合成方向：,5 3,合成位点：,引物,RNA3-OH,模板：亲代单链,DNA,5 3,聚合酶活性,5,3,OH,5 3,外切酶活性：,切除引物,RNA,切除错配的,碱基,引物,RNA,C,5,3,OH,H,2,0,dCMP,3 5,外切酶活性：保真,催化,DNA,聚合,参与,DNA,损伤的应急状态修复,校读、修复合成、切除引物填补空隙,功能,20,40,400,分子数,/,细胞,10,1,1,亚基数,+,5, ,外切酶活性,+,+,+,5,外切酶活性,+,+,+,5, ,聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,E. Coli,中的,DNA,聚合酶,结构：,DNA,聚合酶,I,为一条多肽链，,有,三种酶活性,。,(1)DNA,聚合酶,DNA-pol,的核酸外切酶活性和及时校读,A,：,DNA-pol,的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。,B,：碱基配对正确，,DNA-pol,不表现活性。,(2) DNA-pol ,（,120kD,）,DNA-pol II,基因发生突变，细菌依然能存活,它参与,DNA,损伤的应急状态修复。,功能,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,(3)DNA-pol ,(250kD),1.,遵守严格的碱基配对规律；,2.,聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；,3.,复制出错时,DNA-pol,的及时校读功能。,DNA,复制的保真性至少要依赖三种机制,6.DNA,连接酶,连接,DNA,链,3,-OH,末端和相邻,DNA,链,5,-P,末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的,DNA,链连接成一条完整的链。,DNA,连接酶,(DNA ligase),作用方式,HO,5,3,3,5,DNA,连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目 录,DNA,连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。,在,DNA,修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。,也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,DNA,生物合成过程,The Process of DNA Replication,第,三,节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1,.,DNA,解开成单链，提供模板。,2.,合成引物，提供,3,-OH,末端。,一、原核生物的,DNA,生物合成,E.coli,复制起始点,oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1,.,DNA,解链,Dna A,解旋酶,DNA,拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2,.,引发体和引物,含有,解螺旋酶,、,DnaC,蛋白、,引物酶,和,DNA,复制起始区域,的复合结构称为,引发体,。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链,RNA,分子。,引物,3,HO,5,引物酶,（二）复制的延长,复制的延长指在,DNA-pol,催化下，,dNTP,以,dNMP,的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,5,3,5,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA-pol,复制过程简图,领头链的合成,染色体,DNA,呈线状，复制在末端停止。,复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。,染色体两端,DNA,子链上最后复制的,RNA,引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,三、真核生物,DNA,复制的特点,（一）真核生物,DNA,复制位点,:,呈多点双向复制,（二）参与真核生物,DNA,复制的酶,:,5,种,端粒,(telomere),端粒酶,(telomerase),1.,端粒,(telomere),指真核生物染色体线性,DNA,分子末端的结构。,功能,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制的完整性,结构特点,由末端单链,DNA,序列和蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G,、,C,碱基的短 序列。,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,1,）是一种逆转录酶，是一种核糖核蛋白。,2,）由,RNA,和蛋白质构成，能识别和结合端粒序列。,3,）其中,RNA,大约有,150,个核苷酸，富含,C,x,A,y,，正好与端粒序列,T,n,G,m,的单链呈杂交结合状态。,结构：,2.,端粒酶,(telomerase),特点：,1,）由,RNA,和蛋白质构成的复合物,2,）为特殊的逆转录酶，能以自身的,RNA,为模板逆转录合成端粒,DNA,真核生物染色体,DNA,采取线性复制方式子链,5 ,末端的一段,RNA,引物被水解后，留下的空隙。,则由端粒酶爬行式复制填补。,端粒酶的功能：,解决线性,DNA,末端隐缩,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,端粒的平均长度随培养细胞分裂次数、人类,年龄 ，而逐渐变短，将导致,DNA,复制能力，,细胞分裂障碍，寿命缩短。,端粒酶与衰老,肿瘤的发生,: 1990,年，,G,reider,等人发现，在大约90%人类肿瘤组织中能检查到,端粒酶阳性，而在正常组织中，这种酶表达为阴性或仅有,3,4%,阳性率,.,存在问题：,1.,端粒酶基因剔除：小鼠自发性肿瘤发生率。,2.,人体正常造血干细胞、生殖细胞端粒酶阳性，在肿瘤治疗中如何保护？,3.,对,10,15%,端粒酶阴性肿瘤组织，存在选择性端粒延长途径，能抗端粒酶的治疗。,端粒酶与肿瘤的发生,逆转录,Reverse Transcription,第四节,逆转录酶,(,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶,),1.RNA,指导的,DNA,聚合酶活性,2.RNA,水解酶活性,3.DNA,指导的,DNA,聚合酶活性,逆转录,(reverse transcription),以,RNA,为模板，合成与其互补的,DNA,的过程。,RNA,DNA,逆转录,酶,一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,RNA,模板,逆转录酶,DNA-RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,逆转录酶,A AA A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,cDNA,complementary DNA,逆转录酶催化的,DNA,合成反应也是,53,方向。需要的引物是病毒本身的一种,tRNA,。,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。,逆转录现象说明：至少在某些生物，,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,对逆转录病毒的研究，拓宽了,20,世纪初已注意到的病毒致癌理论。,DNA,损伤（突变）与修复,DNA Damage (Mutation) and Repair,第五节,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为,突变,。,在复制过程中发生的,DNA,突变称为,DNA,损伤,(DNA damage),。,从分子水平来看，突变就是,DNA,分子上碱基的改变。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础,（二）突变导致基因型改变,（三）突变导致死亡,（四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,大量的突变属自发突变，发生频率为,10,-9,用生活环境中导致突变的因素，在实验室可以诱发突变，称为诱变，导致突变的因素称为诱变剂。主要有物理和化学因素。,物理因素,紫外线,(ultra violet, UV),、各种辐射,UV,胸嘧啶二聚体,化学因素,化合物类别,分子改变,碱基类似物（,5-BU,）,A-G,羟胺类（,NH,2,OH,）,T-C,亚硝酸盐（,NO,2,）,C-U,烷化剂（氮芥类）,G-,m,G,三、突变的分子改变类型,错配,(mismatch),缺失,(deletion),插入,(insertion),重排,(rearrangement),框移,(frame-shift),DNA,分子上的碱基错配称,点突变,(point mutation),。,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,1,.,转换,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,2.,颠换,（一）错配,镰形红细胞贫血病人,Hb (HbS),亚基,N-val,his,leu,thr,pro ,val,glu C,肽链,C,A,C G,T,G,基因,正常成人,Hb (HbA),亚基,N-val,his,leu,thr,pro ,glu,glu C,肽链,C,T,C G,A,G,基因,1949,年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。,（二）缺失,、,插入,和框移,缺失：,一个碱基或一段核苷酸链从,DNA,大分子上消失。,插入：,原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到,DNA,大分子中间。,框移突变,是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致,框移突变,。,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C ,缺失,C,缺失引起框移突变,（三）重排,DNA,分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,四、,DNA,损伤的修复,修复,(repairing,),是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,错配修复,(,mismatch repair,),光修复,(light repairing),切除修复,(excision repairing),重组修复,(recombination repairing),SOS,修复,修复的主要类型,MCE scanning,DNA,中的,GATC,(palindromic seq.),为,m,6,A,甲基化敏感位点,平均每,2kb,左右有一,GATC,seq.,3,-,-C-CTAG-CTAG- 5,5,-T-GATC-GATC- 3,3,-,5,（一）错配修复,光修复酶,(photolyase),UV,（二）光修复,（三）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由,DNA-pol,和连接酶完成。,碱基切除修复系统,（,base excision repair,）,核苷酸切除修复系统,（,Nucleotide excision repair,）,ung system (,尿嘧啶,-N-,糖苷酶系统,),-TAGC-,-ATCG-,-TAGC-,-A CG-,U,-TAGC-,ung-ase,G,C,U,A,U,-TAGC-,-A -,Apurinase,(,内切酶,),-TAGC-,-A,DNApol,ligase,TCG-,Base excision repair (BER),Base Excision Repair (BER),2 UvrA proteins form a complex with one UvrB protein in an ATP-dependent reaction,The complex recognizes UV damage by the bend in the helix,The UvrA proteins dissociate from the complex after ATP hydrolysis.,This leaves UvrB bound across from the damage,Nucleotide Excision Repair in E. coli,Now UvrB can recruit UvrC protein to the complex,UvrC activates UvrB to nick the DNA 4 nts 3 from the pyrimidine dimer,Then UvrB activates UvrC to nick the DNA 7 ntds 5 from the pyrimidine dimer,This leaves a fragment of DNA containing the damage that can now be removed,Nucleotide Excision Repair in E. coli,A helicase, UvrD, uses ATP hydrolysis to power the unwinding of the damaged DNA fragment. This reomoves UvrC,The gap in the DNA is now filled in by DNAPI or II, reomving uvrB in the process,Finally, DNA ligase seals the nick,Nucleotide Excision Repair in E. coli,NER in HumansXeroderma pigmentosum (XP),缺乏,NER,系统，不能修复紫外线造成的表皮细胞,DNA,损伤，导致高突变率，所以对日光尤其紫外线特别敏感，易发生皮肤癌,（三）重组修复,先复制在修复,需切除修复辅助,A DNA molecule has a T dimer,this molecule is being replicated. A,PolIII,will be unable to correctly copy the T dimer,DNA,Pol II,reinitiates DNA synthesis downstream of T dimers.,This cannot be repaired by the usual repair systems. However, the exposed ssDNA with the correctly synthesized daughter molecule,One daughter molecule still contains the T dimer but the opposite strand has the correct sequence. The other daughter now contains a gap but this gap can be repaired correctly by the usual repair systems,（五）,SOS,修复,当,DNA,损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。,在,E. coli,，各种与修复有关的基因，组成一个称为,调节子,(regulon),的网络式调控系统。,这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过,SOS,修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而,DNA,保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,