资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,石蜡切片的制作,石蜡切片的过程,动物的处死,动物组织取材,固定,组织固定后的处理,脱水和透明,包埋,切片,一、动物的处死,麻醉,空气栓塞,颈椎脱臼或断头,股动脉放血,二、动物组织取材,动物组织取材原则：,尽量保持组织的生活状态。,动作要快,不要过度用力夹捏组织，防止组织变形。,三、固定,1,、目的：,尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变化、自溶。,保持细胞和组织原有的形态结构，,保持组织内部成分特征不发生变化。,2,、方式：浸入式,灌注式,灌注式,此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或50-100,ml,注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。,灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。,3,、固定液,醛类固定剂,非醛类固定剂,丙酮及醇类固定剂,醛类固定剂,双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。,包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛,通常与其他的试剂联合使用,优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。,缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。,非醛类固定剂,氯化汞（,HgCI,2,）：,蛋白的强固定剂,重铬酸钾：,保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。,苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂，,醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。,蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。,四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与 电镜观察切片的固定与染色。,丙酮及醇类固定剂,丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，低温下保持酶活性效果好。,乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不良。,混合固定剂,固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。,4%多聚甲醛磷酸缓冲液,pH7.4,成分：4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中，,1倍的磷酸缓冲液,:PBS,MV,NaCl,140mM 58.44,KCl,2.7mM 74.55,NaH,2,PO,4,12H,2,O,，,10mM 358.14,KH,2,PO,4,1.8mM,136.09,调,pH,至,7.4,。,Bouin,s,液,苦味酸饱和水溶液,75ml 15,固定糖原,37%-40%福尔马林液 25,ml 5,固定蛋白和脂肪,冰醋酸 5,ml 1,凝固核染色质,固定组织时应注意：,应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。,组织块不易过大过厚，必须小于2,cm1.5cm0.3cm，,尤其是组织块厚度必须控制在0.3,cm,以内。,固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。,固定时间的选择,不同的研究目的所需使用的固定液。,材料的大小，组织的特性与致密度。,温度的不同有所差别。,组织固定后的处理,冲洗或漂洗：,组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。,修块,:,大小合适、去除形态不好的部分，,四、脱水,脱水目的：,运用某种溶剂置换组织内的水分。,脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等,乙醇,：最常用的脱水剂,一般组织：,70%-80%-90%-100%-100%,特殊组织：,30%-40-%-50%-60%-70%-80%-90%-100%-100%,每步,30,分钟左右。,要求：,完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间,不能过度脱水（使组织变脆）,不同组织脱水时间不同：,大的致密的组织需要延长脱水时间,为加速各级酒精的穿透力，脱水可,在,37,温箱中进行。,五、透明或媒浸,目的与作用,对组织的最后脱水处理,与包埋剂置换,透明剂：,苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂,100%,乙醇脱水后进入二甲苯两次，保证透明完全。,六、包埋,包埋剂的特点：,具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。,能完全进入组织。,对组织内部成分损伤小。,石蜡包埋,石蜡特点：熔点：,45-50,软蜡,55-60,硬蜡 常用,石蜡的处理：,新蜡应溶一次，增加密度。,并用滤纸过滤去处杂质。,加,5%10%,的蜂蜡,增加石蜡的韧性。,反复溶的旧蜡包埋效果更好。,程序：在溶蜡箱中进行,55-60,，恒温。,浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（,1,：,1,）中两次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。,包块：在室温进行,七 石蜡切片,载玻片处理：,切片：,展片：背面与玻片。,烘片：,37,的温箱内烤干,(,约需,12,小时,),。,优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄的切片，并且易于制成连续切片，也容易附着于载玻片上。,缺点：,是不适于较大的标本,，材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。,火棉胶切片法,透明剂：乙醚与乙醇等量混合,包埋剂：火棉胶溶于透明剂,包埋：常温进行,凝固：在乙醚中过夜，,在氯仿中过夜。,在,70%,乙醇中保存。,优点：,可切大的组织,可切较硬的组织如硬骨,缺点：操作所用时间长,一般切片厚度为20-30,m。,不能连续切片,全部试剂为易燃物质，注意防火,冰冻切片法,取材：液氮保存,载玻片处理,切片,保存：,-70,或,-20,
展开阅读全文