第十一章抗生素发酵生产工艺课件

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,11.1 概述,11.2 青霉素的发酵生产工艺,11.3 自学,第十一章 抗生素发酵生产工艺,抗生素发酵生产工艺,概 述,11.1 概 述,11.1.1,抗生素的定义和命名,11.1.,2,抗生素的分类,11.1.,3,抗生素生产的技术研究,抗生素概念：由,生物,产生的（或化学合成获得的），能在低浓度下选择性抑制或杀灭其它微生物或肿瘤细胞的有机物质。 抗生素的命名原则：,根据来源抗生素的署名定名的抗生素,根据化学结构和性质定名的抗生素,一些习惯俗名、发现的地名等命名,抗生素发酵生产工艺,概 述,11.1.1,抗生素的定义和命名,产物的生物来源,化学结构,作用机理,作用对象,生产工艺,应用领域,抗生素发酵生产工艺,概 述,11.1.,2,抗生素的分类,工业生产方法,微生物发酵,全化学合成法,半化学合成法,抗生素发酵生产工艺,概 述,11.1.,3,抗生素生产的技术研究,1、微生物发酵法,（即生物合成法）：是利用特定的微生物，在一定的条件下（,培养基、温度、pH、通气、搅拌,等）使之生长繁殖，并在代谢过程中产生抗生素。然后选用适当理化手段将抗生素从发酵液中提取、精制，最后获得符合药典规定的各种抗生素成品。,抗生素发酵生产工艺,概 述,抗生素发酵生产工艺,概 述,1、,生物合成法, 传统方法；, “工程菌”制造法；, 细胞融合技术法 。,抗生素发酵生产工艺,概 述,传统方法,传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用,基因工程和细胞融合,技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。,大多数抗生素是由放线菌产生的。菌种通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用,深层通风搅拌发酵罐,生产。,抗生素发酵生产工艺,概 述,“工程菌”制造法,我国新构建的生产,丁胺卡那霉素,的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的“工程菌” 生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。,第一次由“工程菌”制造的全新抗生素,麦迪紫红素A,，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌”产生了全新的抗生素。,抗生素发酵生产工艺,概 述,细胞融合技术法,目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的新型抗生素问世。,对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高140倍。,返回,抗生素发酵生产工艺,概 述,2、全,化学,合成,法,（即,化学合成法,）：某些抗生素的化学结构已经明确且较简单时，可采用全化学的方法进行合成制取抗生素。,如：,氯霉素、磷霉素,等。,抗生素发酵生产工艺,概 述,氯霉素分子结构图,抗生素发酵生产工艺,概 述,全化学合成法的优缺点,优点,效率较高，受影响因素少，克服了发酵法生产的缺点。,抗生素发酵生产工艺,概 述,缺点,导致严重的环境污染问题。,返回,抗生素发酵生产工艺,概 述,3、半,化学,合成,法,即,半合,成法,，,将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团,进行分子结构改造而获得的新抗生素品种或制成各种衍生物,。,抗生素发酵生产工艺,概 述,半化学合成法,:化学方法改造,此种方法一般分两个阶段进行：,:生物合成法制取,抗生素发酵生产工艺,概 述,19,许多细菌逐渐出现了耐药性，已经证实某些耐药因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果耐药菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。,现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。,抗生素发酵生产工艺,概 述,半合成抗生素的目的：,增强抗菌力；,1,2,对耐药菌有效；,3,4,降低毒副作用或提高生物有效性。,5,扩大抗菌谱；,便于口服；,抗生素发酵生产工艺,概 述,微生物合成抗生素,上游：,菌种保存、选育、孢子及种子制备,发酵适宜的培养基,碳源 氮源 无机盐（微量元素）,前体,下游：,提取 预处理 过滤 进一步提取,结晶干燥,纯品,成品:,制剂工作,抗生素发酵生产工艺,概 述,11.1 概述,11.2 青霉素的发酵生产工艺,第十一章 抗生素发酵生产工艺,11.2 青霉素的发酵生产工艺,11.2.1,青霉素的概述,11.2.,2,生产菌的生物学特性,11.2.,3,发酵工艺过程,11.2.,4,提炼工艺过程,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,11.2.1,青霉素的概述,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,青霉素是抗生素的一种，是从青霉菌培养液中提取的药物，是第一种能够治疗人类细菌感染疾病的抗生素。,青霉素是提纯产品的大规模用于临床的第一种抗生素，和原子弹、雷达被认为是第二次世界大战中最伟大的三项发明。,1 青霉素发现,11.2.1,青霉素的概述,1929: Fleming,在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。,杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。,1939,：病理家,Howard,Florey,、化学家,Ernst,Chain,Norman,Heatley,。发酵瓶培养霉菌，培养物中提取，测活性，青霉素结晶。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2、 作用机理,细胞壁合成中的肽聚糖合成的第三阶段,肽聚糖的,D-,丙氨酰,-D-,丙氨酸二肽类似物,竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。,生长中的细胞有效，静止细胞无效,高效、安全的抗细菌感染药物。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3、 应 用,临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。,毒性小，但需要,皮试,。,各种半合成抗生素的原料：,氨苄青霉素、磺苄青霉素、乙氧萘青霉素、头孢菌素母核。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,6-氨基青霉烷酸,11.2.,2,生产菌的生物学特性,菌种：,Penicillium,chrosogenum,生产能力达到,30000-60000U/mL,当今世界青霉素工业发酵水平已达,85000U/mL,以上,青霉穗,:,分生孢子链状􀂾,深层培养菌丝：球状和丝状两种。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,青霉素生产菌种一般在真空冷冻干燥状态下，保存其分生孢子。,也可以用甘油或乳糖溶液作悬浮剂，在,-70,冰箱或液氮中保存孢子悬液或营养菌丝体。,冷冻营养菌丝体进行保存可避免分生孢子传代时可能造成的变异。一般来说，分生孢子传代比菌丝传代更易发生变异。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,菌种保存,青霉素生产流程图,发酵工艺,冷至,15,结晶器,预处理罐,过滤器,萃取器,蒸发器,工业盐,提炼工艺,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,种子罐,1,和,2,米孢子,发酵罐,琼脂斜面,冷冻干燥孢子,消泡剂、补料,培养基制备,无菌空气,1、种子制备,种子制备阶段包括孢子培养和种子培养两个过程。,孢子培养以产生丰富的孢子（斜面和孢子培养）为目的。,种子培养以繁殖大量健壮的菌丝体（种子罐培养）为主要目的。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,孢子和菌丝的质量对青霉素产量有直接的影响，必须对其生产过程的每一环节严格控制。,11.2.,3,发酵工艺过程,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,1）生产孢子制备工艺,产黄青霉孢子是将砂土孢子用甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的固体培养基进行斜面培养的。,米孢子：转接到大米或小米固体培养基上，,25,生长,7,天,注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2）生产种子制备工艺,一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。,培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消,沫剂等；,培养条件：通气量,1:3,（体积比）；,300,350rpm,；,pH,自然，温度,271, 40h,左右。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2）生产种子制备工艺,一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。,二级,种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量,10,培养基：葡萄糖，玉米浆等。,培养条件：,1:1,1.5,；,250,280rpm,；,pH,自然，,251,。,10,14h,后便可以作为发酵罐的种子。,种子质量要求：菌丝致密，菌丝粗壮。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2、生产罐培养工艺,三级罐：生产罐；接种量,20,培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，,CaCO,3,， 玉米油，硅油。,参数条件：,通气比：,1:0.7,1.8,；,150,200r/min,；,前,60,小时：,pH6.4,6.6,，,26,；,60,小时后：,pH6.7, 24,。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3、发酵培养与过程控制,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,分批发酵来说，发酵生产又分为菌体生长和产物合成两,个阶段。进入生产阶段的必要条件是降低菌丝生长速度,这可以通过限制糖的供给来实现。,3、发酵培养与过程控制,反复分批式发酵,发酵罐：,100M,3,，装料,80M,3,带放,: 6,10,次，带放量,10,，间隔,24h,。,发酵周期：,180,220h,带放：是指发酵到一定时间后，放出一部分培养物。,补料,：,间歇或连续补加一种或多,种成分培养基的操作过程,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.1 过程控制补料分批操作控制基质浓度,前,40,小时：培养基中的主要营养物,40,小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸盐,前体,等，维持一定的最适浓度。,半饥饿状态：延长合成期，提高产量。,碳源占成本,12,以上，采用糖化液流加，降低成本。,糖与,6-APA,结合形成糖基,-6APA,，影响青霉素产量。,前体,：是加入到发酵培养基中的某些化合物，能被直接参与产物的生物合成，组成产物分子的一部分，而自身的结构没有发生多大的变化。,前体能明显提高产品的产量和质量，一定条件下还能控制菌体的,合成方向,。前体不仅具有毒性，而且能被菌体分解，因此，采取少量流加工艺。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,流加碳源控制,根据残糖、,pH,、尾气中,CO,2,和,O,2,含量间接调控。,葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。,残糖,0.3,0.6,左右，,pH,开始升高时流加糖。,浓度：,50kg/M,3,，流速,:1.0,2.5kg/M,3,.h,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,流加氮源控制,玉米浆,:,最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。,补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素,氨基氮浓度：,0.01,0.05%,。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,盐离子控制,无机盐：硫、磷、镁、钾等。,铁对青霉素合成有毒，,30,40,ug,/ml,以下。,罐壁涂环氧树脂保护层。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.2 添加青霉素侧链前体,时期：合成阶段,种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等可作为青霉素,G,的侧链前体,毒性：前体对青霉菌的生长发育有毒性,策略：低浓度流加,浓度：苯乙酸,0.1%,，苯乙酰胺,0.05,0.08%,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.3 温度控制,适宜菌丝生长温度,30,，分泌青霉素,20,。,20,青霉素破坏少，但周期很长。,变温控制，不同阶段不同温度，适合不同发酵阶段的需要。,生长阶段：较高温度，缩短生长时间（,56h,）；生产阶段适当降低温度（,180h,）,，以利于青霉素合成。,前期控制,26,左右，后期降温控制,24,。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.4 pH控制,合成适宜,pH6.4,6.6,左右，碱性下易分解，避免超过,7.0,。,直接加酸或碱：自动控制。,pH,较低时：补加,CaCO,3,、通氨、尿素或提高通气量。,pH,较高时：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）。,根据,pH,值来补糖：,pH,值上升快时多补，下降慢时少补；变速，依赖,pH,变化快慢，以维持适宜的,pH,。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3 .5 溶氧在线控制,溶氧控制：,30,30,饱和度，产率急剧下降,适宜的搅拌速度：保证气液混合，提高溶氧,溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的参考依据指标之一。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3.6 消 沫,天然油脂：玉米油,化学消沫剂：泡敌,策略：少量多次,注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,11.2.,4,提炼工艺过程,青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活,水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定,易溶于有机溶剂，水中溶解度很小,青霉素盐很稳定，易溶于水；降解产物具有致敏性,防止降解，条件温和、快速。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,1,、预处理,改变,发酵液的物理性质,，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率,尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）,去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操作。,1.1 预处理目的,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,1,、预处理,加热法,调节悬浮液的,pH,值,凝聚和絮凝,加入草酸、三聚磷酸钠（,Na,5,P,3,O,10,）、黄血盐等可除去,Ca,2+,，,Mg,2+,，,Fe,2+,等无机离子,1.2 预处理方法,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,发酵液的过滤,板框过滤机,鼓式真空过滤机,1,、预处理,青霉素的存在部位：发酵液,浓度较低：,10,30Kg/M,3,含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等,目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程,预处理：发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,2、过 滤,（,发酵液的固液分离,）,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。,常用的方法为过滤和离心分离等化工单元操作,2、过 滤,（,发酵液的固液分离,）,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,常见的固液分离方法,离心沉降,微孔膜过滤,双水相萃取,影响过滤的因素,菌种：真菌，放线菌，细菌,培养基：黄豆，花生，淀粉，后期加油，培养基未用完,发酵时间：菌丝自溶前放罐,黏度（发酵液）,2、过 滤,鼓式真空过滤机过滤：,一次滤液：,pH 6.2,7.2,，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量,0. 5,2.0%,。,板框式过滤机过滤：,10%,硫酸调节,pH4.5,5.0,，加入,0.07%,溴代十五烷吡啶，,0.07%,硅藻土为助虑剂。,二次滤液：澄清透明，用于提取（收率,90,）,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,3、溶剂萃取,原理,：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。,萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。,工业上通常用：,醋酸丁酯和醋酸戊酯,。,除去蛋白质：加,0.05,0.1%,乳化剂,PPB,。,萃取：,2,3,次。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,逆流萃取过程,正相萃取：酸化,pH 2.0,3.0,，滤液,:,乙酸丁酯,1:0.3,，离心机分离,反相萃取：,pH7.0,8.0,（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从乙酸丁酯中提取到缓冲液中，乙酸酸丁酯：水,1:0.3,反复萃取,2,3,次，达到结晶要求,萃取条件：,10,下。萃取罐冷冻盐水冷却。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,4,、脱色,萃取液中添加活性炭，除去色素、,热原,、过滤，除去活性炭。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,热原是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。G,-,产生的热原反应高于G,+,，是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，引起恶寒高热，甚至休克。常用活性炭吸附或超微过滤办法去除。,5、结晶直接结晶,加醋酸钠乙醇溶液反应：得到结晶钠盐,加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。,5、结晶共沸蒸馏结晶,萃取液，再用,0.5 M,NaOH,调节,pH,中性,加,2-3,倍体积水饱和丁醇，,16,26,，真空,0.67,1.3KPa,下蒸馏。水饱和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出,结晶经过洗涤、干燥（,60,真空,16h,），磨粉，装桶，得到青霉素产品。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,思考题,（1）简述青霉素发酵的工艺过程。,（2）青霉素发酵过程中培养基如何流加控制？,（3）青霉素生产流程。,（4）青霉素提炼工艺工艺过程。,抗生素发酵生产工艺,青霉素发酵工艺,