分子杂交与印迹技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,整理课件,*,第六章,分子杂交与印迹技术,Molecular Hybridization&Blotting Technology,整理课件,一、分子杂交和印迹技术,（一）分子杂交和印迹技术的基本原理；,（二）影响分子杂交的因素；,（三）核酸探针,（四）分子杂交和印迹技术的种类及应用,整理课件,掌握分子杂交及印迹技术的基本原理，分子杂交、探针的概念。,熟悉探针的来源，选择探针的基本原则，寡核苷酸探针的选择要求，探针的同位素标记及非同位素标记的特点及种类。核酸分子杂交种类，Southern Blot、Northern Blot的基本原理、过程及区别,。,了解影响杂交反应的因素，各种杂交条件的选择。,整理课件,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization),分子杂交以DNA的变性和复性为理论基础,。DNA在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由双链变成单链的过程谓之,DNA变性,。变性DNA的单链重新合成双链的过程为,DNA的复性,。,分子杂交是,不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。,在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的,碱基配对,关系，就可以在不同的分子之间形成,杂化双链(heteroduplex),。,一、分子杂交与印迹技术的基本原理,整理课件,DNA,的变性,(denaturation),定义,：,在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,本质：只改变二级结构，不改变核苷酸排列,方法：,过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD,260,增高粘度下降,比旋度下降浮力密度升高,酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,目 录,整理课件,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,整理课件,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA,的紫外吸收光谱,增色效应：,DNA,变性，由于解链使更多的共轭双键暴露，使其溶液,OD,260,增高，并与解链程度有一定的比例关系的现象。,目 录,整理课件,热变性,解链曲线：,如果在连续加热,DNA,的过程中以温度对,A260,（,absorbance,，,A,，,A260,代表溶液在,260nm,处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线,。,目 录,Tm,：,变性是在一个相当窄的温度范围内完成。,在,DNA,变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的,50%,（一半）,时的温度称为,DNA,的解链温度，又称融解温度,(melting temperature,Tm),。其大小与,G+C,含量成正比。,G、C含量越高，Tm越大；DNA越长，Tm越大；溶液的,离子强度增高，Tm增加。,在Tm时，有一半的DNA双链被打开,整理课件,DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义,在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为,复性,。,减色效应,DNA复性时，其溶液,OD,260,降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为,退火(annealing),。,目 录,整理课件,变性和复性的应用：,核酸分子杂交(hybridization),在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成,杂化双链(heteroduplex),。,这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,整理课件,复性,RNA,DNA,整理课件,二、影响杂交的因素,核酸分子的浓度和长度,浓度大，复性快；分子量大，复性慢,温度,离子强度,杂交液中的甲酰胺,核酸分子的复杂性,非特异性杂交反应,整理课件,三、核酸探针,*,探针(probe)概念,一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的,已知序列的多聚核苷酸,，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,探针的种类,基因组DNA探针；cDNA 探针；,RNA探针；寡核苷酸探针。,整理课件,基因组DNA探针：,为某一基因的全部或部分序列；,制备,：基因组文库选取某一基因，与质粒或噬菌,体连接，基因克隆后酶切获得。,PCR扩增基因组DNA片段,注意：真核基因使用编码序列（外显子）作为探针，避免使用内含子和其它非编码序列。,DNA探针的优点：,制备方法简单；相对RNA而言DNA探针不易降解；,DNA探针的标记方法较成熟,整理课件,cDNA探针：,cDNA上指点互补mRNA的DNA分子,优点：不含内含子和高度重复序列,但不易获得.,RNA探针,单链RNA分子,优点:无互补双链的竟争,杂交效率高,稳定性高,不存在重复序列,非特异性杂交较少,可用RNase将未杂交的探针水解,减少本底干扰.,但：易降解；标记复杂,应用:检测DNA、mRNA；观察基因转录及真核基因的表达调控,整理课件,寡核苷酸探针,优点,：,根据需要合成相应序列，可避免天然探针存在的高度重复序列带来的不利影响,链短（1050bp)、复杂性低、分子量小，与点量靶位点完全杂交所需时间短（短于克隆探针）,能识别序列内1个碱基的变化，明显降低杂交的Tm值,可大量合成，价格低、可进行酶学或化学方法进行非放射性标记,设计原则,长度：1050bp（过长，合成困难、杂交时间长；过短，,特异性差）,G+C含量：4060%,探针分子内部无互补序列，否则会引起发夹结构,避免同一碱基重复出现多于4个,一旦选定某一寡核苷酸序列，需与已知的各种基因序列进行同源性比较，若与非靶基因序列有70%以上的同源性，应重新设计,整理课件,DNA探针,通常为400500个碱基，在探针标记过程中可调整DNA探针的长度。,RNA探针,的长度 相对就不那么易控制,探针的长度,探针太短，可与多个位点杂交降低特异性,探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性。,F=(1/4),L,2N,F,值：探针和靶序列杂交的可能频率,L,：,探针的核苷酸数目（长度）,N,：,靶序列的复杂性,DNA和RNA探针,寡核苷酸探针,整理课件,探针的标记,标记物,核素标记物（同位素标记）：,32,P、,35,S、,3,H等,非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等,一个理想的探针标记物：,具有高度灵敏性,标记物与探针结合后不影响杂交时的碱基配对,检测方法有高灵敏性、高特异性、假阳性低、环境污染少、价格低,若用酶学方法标记时，对酶的Km值影响小，也不影响下一步酶促反应,整理课件,可准确定量，灵敏度高可检测固相介质上10fg(10,-15,g)的DNA,本底低，易除去旧探针重新杂交新探针,特异性高,对杂交无影响,放射性标记-应用最多的一类,优点,缺点,短半衰期的探针要求临时制备,随用随标,放射性递减使探针降解,放射性对人体有害,需防护,费用贵,整理课件,无放射性，对人体的危害小,探针性质稳定，可供长时间内持续使用,检测过程快，可同时进行不同标记探针的杂交,本底较低,非放射性标记,优点,缺点,灵敏度和特异性不如放射性探针,杂交条件受到报告基团的限制,重新杂交新探针较困难,整理课件,生物素,地高辛,荧光素：FITC，罗丹明,化学发光物：如ECL,光密度或电子密度标记物,碱性磷酸酶(ALP),辣根过氧化物酶(HRP),非放射性标记物种类,整理课件,探针标记方法,缺口平移法(nick translation),随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物,PCR标记法,末端标记法,探针纯化,整理课件,四、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术,(Southern blotting),用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,（,二）RNA印迹技术,(Northern blotting),用于RNA的定性定量分析,。,（,三）蛋白质的印迹分析,(Western blotting),用于蛋白质定性定量及相互作用研究,。,整理课件,（四）,其他,斑点印迹(dot blotting),原位杂交(in situ hybridization),DNA点阵(DNA array),DNA芯片技术(DNA chip),整理课件,分子杂交实验,目 录,整理课件,整理课件,(一)Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建,DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。,整理课件,Southern,杂交,(Southern bloting),的主要步骤,待测DNA样品的制备、酶切,待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳,凝胶中DNA的变性：碱变性,Southern转膜：,硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜,毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法,探针的制备,Southern杂交,杂交结果的检测,整理课件,Southern印迹杂交法,M,1,2,10SSC,转移缓冲液,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,纸巾,玻璃板,重物,支持物,500g,1,2,与探针同源杂交的基因DNA片段,基因组DNA,DNA酶切片段,内切酶,NC或尼龙膜,NC膜或尼龙膜,整理课件,整理课件,整理课件,(二)Northern,印迹杂交,(Northern bloting),检测RNA（主要是mRNA）的方法,与Southern杂交的不同,靶核酸：RNA,RNA电泳,转膜：不需变性,整理课件,Northern印迹杂交,RNA的提取,由于,RNase,具有活性高、不易灭活的特点，在提取中必须防止,RNase,对,RNA,的降解作用。细胞裂解液,异硫氰酸胍,可以抑制此酶活性。,RNA变性电泳,电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使RNA二级结构解体，才能使RNA,严格按相对分子质量大小分离。变性剂还可促进RNA与硝酸纤维素膜结合。,印迹转移,若待测的,RNA,片段较大，可预先将凝胶置于,0.05mol/L NaOH,中浸泡,20,min，,以水解成较小的片段，再用,20,xSSC,浸泡,45,min，以加快,RNA,的印迹转移。,预杂交,杂交,洗膜,放射自显影或化学显色,整理课件,(三)Western,杂交印迹法,(Western bloting),检测蛋白质,，,即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法,主要步骤：,蛋白质样品的制备,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳,蛋白质的电转移：NC膜,靶蛋白的免疫学检测,靶蛋白于第一抗体（一抗）反应,与标记的第二抗体（酶标二抗）反应,显色反应：酶促反应,整理课件,Western,印迹杂交,整理课件,整理课件,三种印迹技术的比较,整理课件,放射自显影照片,目 录,整理课件,(四)原位杂交,(in situ hybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交,。,特点,能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究,不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高,能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,整理课件,核酸原位杂交的基本步骤,细胞或组织的固定：载玻片,组织细胞杂交前的预处理,用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质,探针的选择和标记,杂交,杂交结果检测,整理课件,整理课件,整理课件,整理课件,DNA点阵,目 录,整理课件,DNA,芯片,(DNA chip),cDNA,芯片,(,cDNA,chip),是指将许多特定的,DNA,片段或,cDNA,片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上,。,基因芯片,基因芯片,(gene chip),整理课件,目 录,整理课件,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，