分子生物学基本技术一课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,质粒的提取(碱法),分子生物学基本技术（一）,三峡大学生物化学教研室,凤晰绷卖庇激朱使春嗣蚀把象孜柏彤纸钞贝峨区吼淹谗樱亨它谬蟹动菌姨分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,质粒的提取(碱法)分子生物学基本技术（一）三峡大学生物化学教,实验目的,了解碱法提取质粒的原理；,掌握碱法提取质粒的方法。,斜尺绦个歹捂瞻丝笑升溅漫歇巾病垒岔鞭颗该辛齐风陛骑浇剪电通亿菲要分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,实验目的了解碱法提取质粒的原理；斜尺绦个歹捂瞻丝笑升溅漫歇巾,一实验背景,质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。,大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。,其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。,弯石呢廖传瞬吹镜瑟鹰滓漱洋技中氢股碱瘩哑稗熏联嘱都标款喜策价寒嫩分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,一实验背景质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到20,质粒特点,质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。,质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子.,年由Lederburg正式命名为质粒。,撒贬骤册蔬持服苫昭奄冀喳歇锰妇堰吁递厩侯叹试综剂淫盖磕方爪荫黑昧分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,质粒特点质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比,结构的三大要素：,多克隆位点,选择标记（耐药性，LacZ）,独立的复制单位,种类：,质粒,噬菌体,酵母人工染色体（YAC）,反转录病毒载体,表达载体等,颅爽储陨夜二棉夕册旱爽急思站刨飞猛姬谗挠贼娄汰骇混畔弟缆醒令弛怨分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,结构的三大要素：颅爽储陨夜二棉夕册旱爽急思站刨飞猛姬谗挠贼娄,质粒类型,质粒按复制方式分为两种类型：,松弛型质粒 和 严紧型质粒,1.松弛型质粒,松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。,严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。,2.严紧型质粒,畅琐忿柿戏宝椭牵船傈磷尾耍蜕考痊饱阮稚妈域胯破车顷捉抚剐较巩斩治分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,质粒类型质粒按复制方式分为两种类型：严紧型质粒复制需要一个质,质粒的应用,大多数基因工程使用松弛型质粒。,严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。,质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。,码读势烽叔股壶毖发革绞驰不马廖徘司葬苯粥募禄朱恫掸锌堪模桃荒漳桨分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,质粒的应用大多数基因工程使用松弛型质粒。码读势烽叔股壶毖发革,质粒提取的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA,要去除的物质：,蛋白,基因组DNA,脂类及小分子杂质,RNA,揭犹顺颧刘闰匙魄霹翼幻锣极别套甩颇湘俗憎英激冕肘俩谍草曼泊底堕今分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,质粒提取的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA揭,分离质粒DNA方法,从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的,碱变性法；,煮沸法；,SDS法；,羟基磷灰石层析法等,各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。,凝诌佑畴何崩陀棋郧掂马计森翁懦雕荡忍导摆腹孽咸卵簇恬帮躲苏辫诬骇分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,分离质粒DNA方法从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常,碱变性法基本原理,在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。,将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,静费诈芹恳鲁计劝矢均煤医濒巫汗阎吧刨基洽癌峦军阑镇逞痪签襟盲饥经分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,碱变性法基本原理在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的,原理示意图,返回目录,返回原理,冈汇享帖谤怨踩杠德儡玲左灶饰晾维怂续抗在颈脂统赞跋领姐酪拍消抖尼分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,原理示意图 返回目录 返回原理冈汇享帖谤怨踩杠德,三个基本步骤：,细菌的生长和质粒的扩增,菌体的收集裂解及质粒DNA的分离,质粒DNA的纯化,峨琴呛贵另汉万峰寓铭狱宵苯竣满庐屎柱染叉拐居镰相乏箔椭喜摆萍臃牢分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,三个基本步骤：峨琴呛贵另汉万峰寓铭狱宵苯竣满庐屎柱染叉,实验试剂,培养基：,胰化蛋白胨 10g,酵母提取物 5g 定容 1000ml pH 7.5,NaCl 10g,：,0.1M NaCl,10mM Tris HCl(pH8.0),1mM EDTA,50mg/ml,溶菌酶 10mg/ml(用10mM TrisHCl pH8.0新鲜配制）,琐敷遥渝世掌心乍梦膳犊会烟浩略她屠咸弦瘤桌淫砍机涨祁钧致刃逼挝含分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,实验试剂培养基：琐敷遥渝世掌心乍梦膳犊会烟浩略她屠咸,试剂,溶液：,50mM 葡萄糖,25mM TrisHCl（pH8.0）,10mM EDTA,溶液：（新鲜配制）,0.2N NaOH,1%SDS,溶液：,5M KAC 10ml,冰醋酸 11.5ml,水 28.5ml,酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖,：10mM Tris-HCl(pH8.0)1mM EDTA,亚思妖杂孩育拭庄袭裙慈谎甜山牌譬呀套注皿班堵贸受炽铂按谷窗恰节嘴分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,试剂溶液：亚思妖杂孩育拭庄袭裙慈谎甜山牌譬呀套注皿,实验仪器,（一）仪器,1.恒温摇床,2.超净工作台,3.高压灭菌锅,4.高速台式离心机,5.微量取液器,虫摹戒篆朵茧使猎瘪板贬获阐赫免两撞坐晒椭星缴桔嗽蝉戏潜概螺彰律侍分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,实验仪器（一）仪器 虫摹戒篆朵茧使猎瘪板贬获阐赫免两撞坐晒,湖贤惶蚤此攒今攀汇米哟添渍琵济磁昔犊训嘿祝喘鹤辟葱崇炸痞积冕憎骆分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,湖贤惶蚤此攒今攀汇米哟添渍琵济磁昔犊训嘿祝喘鹤辟葱崇炸痞积冕,Insert,EcoR1,Xho1,1.9kb,粳忍愿簇宙死雀捧你亚涌卡瞄正烷尧刁犊睦西仗贰姨氰尺媳俊扦淘篆辑巡分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,InsertEcoR1Xho11.9kb粳忍愿簇宙死雀捧你亚,三实验方法,挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50g/ml），强烈摇荡过度。,取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。,将细菌沉淀悬浮于100l预冷溶液中，振荡混匀，冰上放置5分钟。,加入200l溶液，盖严管盖轻柔颠倒次以混匀内容物，冰上放置5分钟。,加入150l溶液，温和振荡数次，冰上放置分钟。,12000g 4 离心分钟，取上清移到个新的Eppendorf管中。,生侍峭畸叉李铝嫁毒娄最乳臼鸦盲断虫既蓬咎簇诬飘雍放故按甸锦钞散茫分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,三实验方法挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养,(加入等体积酚/氯仿（：），振荡混匀，12000g 4 离心分钟。取上清移至另个Eppendorf管中。),加入倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。,g,4 离心分钟。,弃上清，加入ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，000g 于4 离心分钟。,弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。,加入50l TE（含20g/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。,泅湾濒戳筑涨除付浦唱秀麦仍耻偷血寸草喇菇后茫轰柿笋铅漳蛤榴聪衔儒分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,(加入等体积酚/氯仿（：），振荡混匀，12000g,四结果分析,质粒DNA OD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和纯度。,记录电泳结果并说明结果内容。,娥剂罩亚疥养甘若溢烛砷朵挪吩辩碾鸿胰揽垃北彤苹绳苟去喷撑首戌净控分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,四结果分析娥剂罩亚疥养甘若溢烛砷朵挪吩辩碾鸿胰揽垃北彤苹绳,问题与讨论：,简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。,简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的现象及其成因。,3.沉淀时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？,护颂遣略斤烟堡豆懦浑邓盒侍物倪顽袭已炔捆围题攒杰涝赴渍骂媳鞋淋编分子生物学基本技术一分子生物学基本技术一,问题与讨论：简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及,