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*,*,*,第,15,课时,聚合酶链式反应技术,第,4,章现代生物技术,1,学习导航,1.,阅读教材,P,77,78,内容，掌握,PCR,技术原理。,2.,结合教材,P,79,80,内容，了解,PCR,技术的基本操作过程，讨论,PCR,技术的影响因素。,重难点击,1.,简述,PCR,的原理。,2.,了解,PCR,技术的基本操作过程并讨论,PCR,技术的影响因素。,2,一、,PCR,的原理,二、,DNA,片段的,PCR,扩增和产物检测,内容索引,当堂检测,3,一、,PCR,的原理,4,基础梳理,聚合酶链式反应简称,PCR,，是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术，这项技术中,DNA,复制的过程和细胞内,DNA,复制的过程是类似的，请结合已学习的,DNA,分子结构和复制的相关知识，分析,PCR,的原理。,1.DNA,的平面结构示意图,5,(1),写出各个标号的名称,；,；,；,；,；,；,；,；,；,。,胞嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤核糖,胸腺嘧啶,脱氧核糖,磷酸基团,胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸,氢键,碱基对,一条脱氧核糖核苷酸链,6,(2)DNA,的两条链是反向平行的，为了明确表示,DNA,链的方向，通常将羟基末端称为,3,端；将磷酸基团的末端称为,5,端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。,答案,左链上,5,端，下,3,端；右链上,3,端，下,5,端。,7,2.,细胞内,DNA,复制条件分析,条件,组分,作用,模板,DNA,的,条单链,提供复制的模板,原料,四种,_,合成,DNA,子链的原料,酶,解旋酶,打开,_,DNA,聚合酶,催化,_,能量,_,为解螺旋和合成子链供能,引物,RNA,为,DNA,聚合酶提供合成的,起点,脱氧核糖核苷酸,两,DNA,双螺旋,合成,DNA,子链,ATP,3,端,8,3.PCR,原理与反应过程,(1)PCR,概念：是一种,的技术，它能以极少量的,DNA,为模板，在几小时内复制出上百万份的,DNA,拷贝。,体外酶促合成特定,DNA,片段,9,(2),条件及作用,条件,作用,待扩增的目的,DNA,片段,作为复制的模板,两种人工合成的单链,DNA,片段,_,四种三磷酸脱氧核苷酸,_,_,酶促作用,_,反应介质,合成,DNA,时所需要的特异引物,原料,耐热,Taq,DNA,聚合酶,缓冲溶液,10,(3),反应过程,变性,温度上升到,时，目的,DNA,双链,为单链模板。,复性,温度下降到,左右，两种引物通过,与两条单链,DNA,结合。,94,98,变性解旋,40,60,碱基互补配对,11,延伸,温度上升到,左右，溶液中的,在耐热的,_,的作用下。根据碱基互补配对原则合成新的,DNA,链。,循环：继续上述的,3,个过程，,DNA,片段被不断的扩增。若开始加入了,N,个,DNA,模板片段，理论上，循环,n,次后能获得,个,DNA,片段。,72,四种脱氧核糖核苷酸,Taq,DNA,N2,n,聚合酶,12,1.PCR,原理,PCR,反应与体内,DNA,复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。,答案,不相同。体内,DNA,复制所需引物为,RNA,聚合酶合成的一小段,RNA,，但,PCR,反应时所用引物一般是人工合成的单链,DNA,片段。,问题探究,答案,13,答案,2.PCR,反应过程,(1)PCR,反应中需要解旋酶和,DNA,聚合酶吗？若需要，则与细胞内,DNA,复制有何区别？,答案,PCR,反应不需要解旋酶，但需要,DNA,聚合酶。由于,PCR,反应中需要高温使,DNA,解旋，因此,PCR,所需的,DNA,聚合酶需耐高温。,(2)PCR,的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。,答案,每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于,Taq,DNA,聚合酶发挥作用。,14,(3),结合下图分析,PCR,过程中,DNA,复制的方向是怎样的？,答案,DNA,的羟基,(OH),末端为,3,端，磷酸基团的末端为,5,端。当引物与,DNA,母链通过碱基互补配对结合后，,DNA,聚合酶就能从引物的,3,端开始延伸,DNA,链，,DNA,的合成方向总是从子链的,5,端向,3,端延伸。,答案,15,PCR,扩增与,DNA,复制的异同,项目,DNA,复制,PCR,扩增,不同点,时期,有丝分裂间期或减数分裂,前的间期,任何时期,场所,活细胞内,细胞外,酶,解旋酶、,DNA,聚合酶,耐高温的,Taq,DNA,聚合酶,引物,有转录，产生,RNA,作引物，无需人工加入,无转录，无引物产生，需人工加入两种,DNA,引物,特点,边解旋边复制,先全部解旋后开始复制,归纳总结,16,不同点,缓冲液,不需缓冲液,配制缓冲液代替细胞核液,设备,无,控制温度变化的温控设备,相同点,原理,严格遵循碱基互补配对原则,引物,都需要分别与两条模板链相结合的两种引物,模板,DNA,的两条链为模板,特点,半保留复制,原料,游离的四种脱氧核苷酸,17,拓展应用,1.,下列关于,DNA,复制和,PCR,技术的描述中，正确的是,A.DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，只能从,5,端延伸,DNA,链,B.DNA,复制不需要引物,C.,引物与,DNA,母链通过碱基互补配对进行结合,D.PCR,扩增的对象是氨基酸序列,解析,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，故,DNA,复制需要引物；,DNA,聚合酶只能从,3,端延伸,DNA,链，而不能从,5,端延伸,DNA,链；,引物通过碱基互补配对原则与,DNA,母链相结合；,PCR,扩增的对象是,DNA,，不是氨基酸序列。,答案,解析,18,2.PCR,技术有效地解决了因为样品中,DNA,含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的,DNA,复制相比，,PCR,可以快速扩增所需的,DNA,片段，请分析回答下列有关问题：,(1),体内,DNA,复制过程中用解旋酶打开双链,DNA,，而,PCR,技术中的解旋原理是,。,解析,PCR,技术中用高温使,DNA,分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是,DNA,的热变性原理。,答案,解析,DNA,的热变性原理,19,(2),此过程需要一种,Taq,DNA,聚合酶，该酶是从,中分离的。,解析,Taq,DNA,聚合酶是从水生耐热细菌,Taq,中提取的。,(3),与普通,DNA,聚合酶相比，,Taq,DNA,聚合酶具有的特性是,。,解析,与普通,DNA,聚合酶相比，,Taq,DNA,聚合酶在,90,以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。,(4),与体内,DNA,复制相比较，,PCR,反应要在,中才能进行，并且要严格控制,条件。,解析,PCR,反应需要适宜的温度和,pH,，因此,PCR,反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。,答案,解析,水生耐热细菌,Taq,耐高温,一定的缓冲溶液,温度,20,(5)PCR,中加入的引物有,种，加入引物的作用是,。,解析,PCR,需要两种引物，引物的识别位点决定了,PCR,扩增的,DNA,片段。,PCR,中加入的引物一般是一小段单链,DNA,，作用是引导,DNA,复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为,DNA,复制的起点。,答案,解析,2,作为,DNA,复制的起点,21,一题多变,细胞内的,DNA,复制需要适宜的温度和,pH,吗？若需要，是如何实现的？,答案,需要。细胞内的适宜温度和,pH,与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。,答案,22,与,PCR,原理有关的三个易错点,(1),酶的作用位点：解旋酶的作用是使,DNA,两条链之间的氢键断开；,DNA,聚合酶与,DNA,连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。,(2)DNA,聚合酶和,DNA,连接酶：,DNA,聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的,3,端上，需要模板；而,DNA,连接酶连接的是两条,DNA,片段的缺口，不需要模板。,(3)PCR,中的解旋过程：,PCR,过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，,DNA,加热变性后变为单链，并未分解成单体。,易错提醒,23,二、,DNA,片段的,PCR,扩增和产物检测,24,基础梳理,DNA,片段的,PCR,扩增可以利用,PCR,热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。阅读教材，完善下列内容：,1.DNA,片段的,PCR,扩增,：按照,PCR,反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上,：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分,：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁,准备,移液,混合,25,：将微量离心管放在离心机上，离心约,10 s,，目的是使反应液集中在,离心管底部,：将离心管放入,PCR,仪中，设置程序进行反应,(1),加入离心管中的物质应包括：,、,酶、,4,种,_,、,2,种,、缓冲液。,(2),离心管中要加入少量石蜡油，目的是,。,离心,反应,模板,DNA,Taq,DNA,聚合,三磷,酸脱氧核苷酸,引物,防止反应溶液的挥发,26,(3),热循环仪的反应程序应设定为：,94,94,40,72,27,(4),影响因素：在,PCR,实验中，需要扩增的,DNA,片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间,；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，,A,、,T,含量越多，复性温度就,，反之引物越长，,G,、,C,含量越多，复性温度就,，这是因为,G,、,C,之间是由,_,个氢键连接，,A,、,T,之间是由,个氢键连接。,(5)PCR,过程中，循环次数是不是越多越好？,答案,不是。,Taq,DNA,聚合酶在,PCR,扩增过程中存在,1,10,5,的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。因此，,PCR,过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在,25,35,个循环。,越长,越低,越高,3,2,28,2.,扩增产物的检测,(1),原理：琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的,DNA,分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。,DNA,片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小，因此大小一致的,DNA,分子会在凝胶的一定位置形成,DNA,条带。,(2),过程,配制质量分数为,1%,的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板,在,DNA,样品中加入,0.2,倍体积的,混匀,载样缓冲液,29,取,20 L,加入,内,V,稳压电泳,20,40 min,当,指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源,将胶板浸入,溶液染色,5,10 min,在,上观察电泳条带,样品孔,80,溴酚蓝,溴化乙锭,紫外透射仪,30,问题探究,答案,1.,实验过程分析,(1),离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？,答案,离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。,(2),在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？,答案,离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。,31,(3)PCR,实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？,答案,为避免外源,DNA,等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。,2.,结果检测,(1),实验中为什么要测定,DNA,的含量？,答案,实际操作过程中会有许多因素影响,DNA,含量，所以需要对,DNA,含量进行测定。,答案,32,(2),如何判断,DNA,扩增成功？,答案,可以通过计算,DNA,含量来评价扩增的效果。,电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察,DNA,带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。,(3)PCR,扩增过程可能会出现哪些异常结果？,答案,样品产物少，或产生新的,DNA,。,答案,33,归纳总结,PCR,扩增,DNA,片段的操作要点,(1),避免外源,DNA,的干扰，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。,(2),缓冲液、酶、,DNA,引物和,DNA,模板等如果长期保存，需要在,20,冰箱内保存。其中，,DNA,引物和,DNA,模板要避免反复冻融，否则容易造成,DNA,的降解。,(3),在用微量移液管混合,PCR,反应体系的各种成分时，一定注意避免各种溶液之间的相互污染，需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。,34,(4),为防止,DNA,引物与模板,DNA,在室温非特异性结合进行,PCR,反应，需在冰盒上混合,PCR,扩增体系的各种组分。,(5),为避免反应过程中高温使,EP,管中的水蒸气溢出管外而导致,PCR,过程中各种成分的浓度发生变化，须在,PCR,反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。,35,拓展应用,3.,使用,PCR,仪具体实验操作顺序应为,设计好,PCR,仪的循环程序,按配方准备好各组分,用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分,进行,PCR,反应,离心使反应液集中在离心管底部,A.,B.,C.,D.,解析,PCR,反应的操作步骤一般分为准备,(,包括配制配方及将各配方放于实验台上,),移液,混合,离心,反应。,PCR,仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。,答案,解析,36,4.,近,20,年来，,PCR,技术,(,聚合酶链式反应,),成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用,DNA,半保留复制，在试管中进行,DNA,的人工复制,(,如图,),，在短时间内，将,DNA,扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。,37,(1),加热使,DNA,双链间的,键完全打开，称为,；而在细胞中是在,酶的作用下进行的。,(2),如果只需要大量克隆模板,DNA,中间的某个特定区段，应该加入,种特定的引物。当温度降低至,40,时，引物与两条,“,舒展,”,的模板链的特定位置结合，在,DNA,聚合酶的作用下，只能在引物的,端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是,。,(3)PCR,技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的,和,，前者由,自动调控，后者则靠,来维持。,(4),通过,PCR,技术使,DNA,分子大量复制，如果将一个用,15,N,标记的,DNA,分子放入试管中，以,14,N,标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则,15,N,标记的,DNA,分子占全部,DNA,分子总数的比例是,。,答案,解析,问题导析,氢,解旋,解旋,两,3,从子链的,5,端向,3,端延伸,温度,酸碱度,PCR,仪,缓冲液,1/8,38,问题导析,(1),解旋是使,DNA,双链间的氢键断裂，,PCR,技术是利用,DNA,的,原理，细胞内是在,酶的作用下解旋。,(2)DNA,分子不论复制几次，含有,15,N,标记的,DNA,分子都只有,个。,返回上页,答案,热变性,解旋,2,39,解析,(1)PCR,技术利用热变性原理使,DNA,双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。,(2)PCR,分为三个基本反应步骤：变性,(94,98,),、复性,(40,60,),、延伸,(72,),，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增,DNA,序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，只能从引物的,3,端延伸,DNA,链，则,DNA,的合成方向总是从子链的,5,端向,3,端延伸。,(3)PCR,技术与细胞内的,DNA,复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境,(,稳定的缓冲溶液,),，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。,(4),一个,DNA,分子连续复制四次之后，形成,16,个,DNA,分子，,15,N,标记的,DNA,分子有,2,个，则,15,N,标记的,DNA,分子占全部,DNA,分子总数的比例为,1/8,。,返回上页,40,课堂小结,引物,复性,延伸,PCR,仪,琼脂糖凝胶电泳,41,当堂检测,42,1.,用于,PCR,的引物长度通常为,20,30,个核苷酸，是一小段,A.DNA,B.RNA,C.,单链,DNA,或,RNA,D.,双链,DNA,2,3,4,5,1,答案,43,2.,符合,PCR,反应条件的一项是,稳定的缓冲液环境,DNA,模板,合成引物,四种脱氧核苷酸,DNA,聚合酶,DNA,解旋酶,限制性内切酶,温控设备,A.,B.,C.,D.,解析,PCR,反应模拟的是生物细胞内,DNA,复制的条件，只是无需解旋酶,(,可热变性,),，也不需要基因工程的工具酶,(,限制性内切酶,),。,答案,解析,2,3,4,5,1,44,3.,下列关于,PCR,的描述中，正确的是,PCR,是一种酶促反应,引物决定了扩增的特异性,扩增,DNA,利用了热变性的原理,扩增的对象是氨基酸序列,A.,B.,C.,D.,解析,PCR,是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术，在高温条件下，把,DNA,的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的,DNA,聚合酶，同时，还需要引物，从引物的,3,端连接脱氧核苷酸。,答案,解析,2,3,4,5,1,45,4.,下图所示为,PCR,扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物,答案,2,3,4,5,1,解析,A.,第一次循环,B.,第二次循环,C.,第三次循环,D.,第四次循环,46,2,3,4,5,1,解析,在,PCR,反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的,DNA,为模板，两条,DNA,链可分别由引物,和引物,与其结合并在,DNA,聚合酶的作用下延伸，所以形成的,DNA,中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的,DNA,分子又可作为模板参与反应，所以会形成,DNA,分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。,47,5.,聚合酶链式反应,(PCR),是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术。请回答下列问题：,(1)DNA,的两条链是反向平行的，通常将,的末端称为,5,端，当引物与,DNA,母链通过碱基互补配对结合后，,DNA,聚合酶就能从引物的,开始延伸,DNA,链。,解析,一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是,3,端，含磷酸基团的是,5,端。引物的,5,端与模板链的,3,端结合，然后沿着引物的,3,端延伸。耐高温的,Taq,DNA,聚合酶的发现是实现,PCR,的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。,PCR,一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。,2,3,4,5,1,磷酸基团,3,端,答案,解析,48,(2)PCR,利用了,DNA,的热变性原理解决了打开,DNA,双链的问题，但又导致了,DNA,聚合酶失活的新问题。到,20,世纪,80,年代，科学家从一种,Taq,细菌中分离到,，它的发现和应用解决了上述问题。要将,Taq,细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫,。,(3)PCR,的每次循环可以分为,三步。假设在,PCR,反应中，只有一个,DNA,片段作为模板，请计算在,5,次循环后，反应物中大约有,_,个这样的,DNA,片段。,(4),简述,PCR,技术的主要应用：,_,(,要求至少答两项,),。,2,3,4,5,1,答案,耐高温的,Taq,DNA,聚合酶,选择培养基,变性、复性和延伸,32,遗传疾病的临床诊断、法医鉴定、古生物学、,基因克隆和,DNA,序列测定等,49,
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