最低检测限与

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,最低检测限与,线性范围试验,(,双缩脲法测定血清总蛋白,),教学要求与目的,掌握：,1.,线性试验的原理、用途。,2.,最低检测限的定义及其评价方法。,3.,血清总蛋白的测定原理及操作方法。,熟悉：,1.,可报告范围、分析测量范围的概念。,2.,生物检测限与功能灵敏度的概念。,3.,血清总蛋白测定的临床意义。,一、血清总蛋白测定,凯氏定氮法,参考方法,双缩脲法,常规测定方法,酚试剂法,染料结合法,浊度法、紫外光谱法,（一）实验原理,蛋白质,+,Cu,在,540nm,波长处有吸收峰，在一定浓度范围内其吸光度增加与蛋白含量成正比，由此可求得蛋白质含量。,OH,2+,紫红色络合物,（二）实验试剂,1,、双缩脲试剂,2,、标准液,本试剂盒为总蛋白,50g/L,氢氧化钠,酒石酸钾钠,硫酸铜,碘化钾,（三）操作方法,1,、操作参数：,波长：,540nm,温度：,37,测定模式：终点法,2.,操作步骤,（,ul,）,B,S,U,DH2O,20,标准液,20,血清,20,双缩脲试剂,1000,1000,1000,混匀，,37,水浴,10,分钟，在,540nm,波长处，用空白管调零，读取各管吸光度。,3,、计算,血清总蛋白,(g/L),=,测定管吸光度,标准管吸光度,蛋白标准液浓度,（,50,g/L,）,参考值,：,60,83g/L,（四）注意事项,严重溶血和黄疸可使测定结果偏高,可,作标本空白管消除。,2.,脂肪乳糜干扰比色，可加丙酮离心。,3.,右旋糖酐可使测定产生混浊影响结果。,4.,灵敏度较低。,1.,精密度较好、准确度较高，,WHO,推荐方法。,（五）方法学评价,3.,操作简便你、快速，成本低廉。,2.,线性范围宽（,10-120g/L,）。,（六）临床意义,1,.,蛋白浓度升高,（,1,）血液浓缩：脱水、外伤性休克等。,（,2,）,蛋白质,合成增加：多发性骨髓瘤、免疫增殖病等。,（,3,）蛋白质合成障碍：如肝脏疾病。,（,1,）蛋白丢失：如肾病综合征。,2,.,蛋白浓度降低,（,2,）摄入不足：营养不良。,二、检测低限试验,检测低限（,LLD,）：指当标本中不含有待测分析物时，反应响应量可能出现的数值范围，即单次测量可达到的非空白检测响应量对应的分析物量。,生物检测限（,BLD,）：某样品单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响 应量时，该样品内含有的分析物浓度或其它量值。,功能灵敏度（,FS,）：以日间重复,CV,为,20%,时对应检测限样品具有的平均浓度确定为检测系统或方法可定量报告的分析物的最低浓度或其它量值。,（一）原理,选择合适的空白标本，该标本与待测标本的区别在于不含有待测物质，一般用处理过的标本或一般标本，在分析步骤中省去关键试剂或操作。本次实验采用蒸馏水作为空白标本，采用双缩脲法进行多次测定，求出吸光度的均值及标准差，计算最低检测限。,（二）操作步骤,（,ul,）,B,S,U,（,1-10,）,DH2O,20,标准液,20,双缩脲试剂,1000,1000,1000,混匀，,37,水浴,10,分钟，在,540nm,波长处，用空白管调零，读取各管吸光度。,（三）计算,1.,计算,10,次测定的平均吸光度及标准差。,2.,计算最低检测限：平均吸光度,+3S,3.,将吸光度值转换成浓度单位。,LLD=A,低,/A,标,C,标,可报告范围（,RR,）,：指可以报告的所有结果的范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。,三、线性范围试验,分析测量范围（,AMR,）：指对没有进行任何预处理（稀释、浓度等）的标本，由检测系统直接测量得到的待测物的可靠结果范围，在此范围内一系列不同样本分析物的测量值与其实际浓度（真值）呈线性比例关系。也即线性范围。,临床可报告范围（,CRR,）：指定量检测项目向临床能报告的检测范围，患者样本可经稀释、浓缩或其它,预处理。,（一）原理,线性范围是指系统最终输出值（浓度或活性）与被分析物浓度或活性成比例的范围。线性范围的测定即测定浓度曲线接近直线的程度，它反映整个系统的输出特征。,本试验使用不同浓度的总蛋白标准溶液，用双缩脲试剂测定各自的浓度，以标准液预期浓度为横坐标，测得浓度为纵坐标，在坐标纸上作图，即可绘制出一条直线，即计量反应曲线。,（二）试剂,1.,蛋白质标准液（,50g/L,）,2.,混合血清（,100,g/L,）,3.,双缩脲试剂,（三）操作步骤,各测定管均测定双份，混匀，,37,水浴,10,分钟，在,540nm,波长处，用空白管调零，读取各管吸光度。,（,ul,）,B,S,U1,U2,U3,U4,U5,DH2O,20,16,12,8,4,标准液,20,血清,4,8,12,16,20,试剂,1000,1000,1000,1000,1000,1000,1000,（四）记录实验数据,（五）评价,1.,目测法：是评估几个不同浓度样本的多次测量均值与实际值之间是否具有肉眼上的直线关系。没有用到统计学方法来验证线性。,2.,平均斜率法：是采用最小二乘法直线回归作统计分析方法。,以总蛋白浓度预期值为横坐标，测定值为纵坐标，在坐标纸上作图，若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，建立回归方程,y=a+bx,，要求,a,接近于,0,，,b,在,0.971.03,之间，若满足此条件，则可直接判断该测定方法是否在所要求的线性范围。,若,a,较大，,b1.03,或,0.97,则认为在高浓度或低浓度处的实测值和预期值间有较大偏差。试着舍去某组数据，另作回归分析，直到,a,接近于,0,，,b,在,0.971.03,之间，此时缩小的分析范围是真实的可报告范围。,下次课预习内容,标准曲线制作（赖氏法测定,ALT),谢 谢！,