06-培养基的组成、配制与灭菌

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,温故而知新,1、真菌生产中，菌种是如何得来的？,2、一级、二级、三级菌种分别有什么作用？,？,？,？,？,？,？,第,一,节 培养基的配制,培养基是根据药用真菌生长发育所需要的各种营养物质，,采用人工配制或直接利用天然产物作培养的基质。,培养基除含有满足药用真菌所要求的,碳源、氮源、无机盐类及各种必要的维生素营养成分外，有些特殊要求的应加一定量微量元素。,此外，,还应保证其所要求的其它生活条件，如,适量的水分，适宜的酸碱度、合适的透明度、固化性,等。,一、培养基的组成和作用,培养基（medium）是,真菌,培养的重要材料，是,真菌,生长的营养物质,来源,，只有配制出适宜的培养基，才能使,真菌,培养获得成功。,通常,真菌,培养所用培养基包括以下六大类成分，即,碳源、,氮源,、有机成分、矿质营养、琼脂以及其他附加物等,。,培养基的主要指标是,营养成分及,碳氮比,。,一、培养基的,种类,（一）根据物理性状分类,1、,液体培养基,液体培养基是根据各种药用真菌所需的营养成分，按一定的配比混合而成的营养液。液体培养基由于有利于药用真菌菌丝细胞对营养物质的接触和吸收，繁殖生长迅速。适用于药用真菌菌种生产和菌丝体生产。在实验室里，液体培养基常用于药用真菌的生理测定。,一、培养基的,种类,（一）根据物理性状分类,2、,半固体培养基,液体培养基中添加少量琼脂（0205）或一定量的玉米粉、麸皮等，使之成为半固体状态，称为半固体培养基。适用于菌种的分离、培养和保藏母种。,一、培养基的,种类,（一）根据物理性状分类,3、,固体培养基,在液体培养基中，加人适量的凝固剂即可制成固体培养基。常用的凝固剂有琼脂、明胶、硅胶等。一般多用琼脂，琼脂的添加量根据季节不同而有所不同，冬天1520，夏天2025，超过25，培养基易分裂，影响菌丝生长。适用于菌种的分离、培养和保藏原种用。,一、培养基的,种类,（一）根据物理性状分类,3、固体培养基,在药用真菌生产中，用各种富含纤维素和木质素的木屑、棉籽壳、甘蔗渣、稻草、麦杆等做为原料，加入一定量的辅助营养物质和水，便可制成木屑或棉籽壳等培养基，这些培养基也称为固体培养基。,一、培养基的,种类,（二）根据营养物质分类,1、,天然培养基,是指用天然有机物配制而成的培养基。如小麦、大豆、玉米、麸皮、米糠、马铃薯、各种禾杆、木屑、棉籽壳、甘蔗渣等农林副产品及其下脚料，以及动植物组织的浸出液，如牛肉膏、肉汤、马铃薯汁、麦芽汁、豆芽汁等都可以用来配制天然培养基。,一、培养基的,种类,（二）根据营养物质分类,1、,天然培养基,这种培养基含有丰富的营养物质，来源广泛、成本低，适合于菌种分离、培养、保藏及药用真菌大规模生产用。这些天然有机物化学成分比较复杂，几乎无法完全了解，即使是同一种物质，因产地、采收季节、提取方法和品种的不同，其营养组成和含量也不尽相同，不宜作为药用真菌生理研究的培养基。,常用的天然培养基，如马铃薯琼脂培养基、木屑麸皮（或米糠）培养基和堆肥培养基等。,一、培养基的,种类,（二）根据营养物质分类,2、,半合成培养基,是用成分未知的天然物质和成分已知的物质配成,。如PDA培养基中的马铃薯是未知成分的天然物质，而葡萄糖是已知化学成分的物质。马铃薯的成分因品种、成熟度和施肥栽培条件不同，每次用其配成的培养基不可能是相同的。,因此，在天然培养基中添加适量的无机盐，或在合成培养基中添加某些天然有机物配制而成的培养基，都称半合成培养基。是菌种生产和药用真菌栽培中常用的培养基。,一、培养基的,种类,（二）根据营养物质分类,3、合成培养基,是指采用化学成分和浓度已知的有机化合物，包括碳水化合物、含氮化合物、有机酸类，无机盐及生长素配制而成的培养基,。这类培养基组成和含量明确，一般用于药用真菌的有关营养、代谢等生理生化研究，以及菌种的纯培养和菌种保藏。,一、培养基的,种类,（三）根据培养基特殊用途分类,1、,基础培养基,基本营养成分,2、,加富培养基,添加了高营养成分,3、,鉴别培养基,加入某种成分，以区别不同真菌,4、,选择性培养基,对培养对象有选择作用,二,、培养基,配方的选择,（一）培养基配制的一般原则,1、,要含有所培养的菌类生长所必需的各种营养物质，如水分、碳源、氮源、无机盐、维生素等。,且所含的养分浓度适宜，比例平衡，各种成分的浓度配比要合理。有利于培养物的吸收利用。,2、具有一定的生长环境，,要有适宜的pH和缓冲能力,。,3、,必须经过严格的灭菌，使之保持无菌状态。,二,、培养基,配方的选择,（一）培养基配制的一般原则,4、,培养料的选择,在菌种制备过程中，从母种、原种至栽培种，各个阶段的目的要求有所不同，所选用的培养基的配比也应有所区别。,5、,营养成分的配比,培养料的碳氮比（C/N）是否适宜，是衡量其质量好坏的重要指标，直接影响药用真菌的发生时间和产量。,二,、培养基,配方的选择,（二）培养基配制所需的营养,1、碳源,2、氮源,3、无机盐类,4、生长素,5、水分,6、凝固剂,（一）,碳源,：,碳是真菌细胞的结构物质和能源物质。,在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质称为碳源,。,糖类是提供碳源的重要形式，真菌可以利用多种碳的化合物如单糖（葡萄糖），双糖（蔗糖、麦芽糖），有机酸、氨基酸、某些醇类、多环化合物和天然碳源。,最常用作真菌生长的碳源是葡萄糖,，葡萄糖可以为大多数真菌很好的利用。,（一）,碳源,：,碳源的浓度也是很重要的，,当尚未准确地知道某种真菌所需要的碳源浓度时，一般使用碳源浓度不超过2%。,生长中为了促使菌丝生长，常常在木屑、秸秆等培养基中加入适量蔗糖等容易利用的碳水化合物作为培养初期的补助碳源，并且还可以诱导纤维酶的利用，让真菌更好的吸收利用。,但是这种补充碳源的浓度一般以0.5%,-,5%为宜,。,（,二,）,氮源,：,氮素是构成菌丝中的蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸又是细胞质和细胞核的主要成分，他们在生命活动中起着重要的作用。,有机氮（如氨基酸、蛋白质、尿素）和氨态氮（如硫酸铵等）都是菌丝细胞所需氮源的主要来源。,大多数真菌可直接利用无机氮素化合物，,其中以铵盐和硝酸盐为最佳。但是高等担子菌是不能利用硝酸盐的。,（,三,）,无机盐类,：,菌丝体所需要的无机盐类数量很少，但它们在菌丝体的生命活动中是不可缺少的，在配制培养基时一般要添加一定的矿质营养，如磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸钙等，,真菌主要从这些矿质营养中获得磷、钾、硫、钙、镁等金属元素,。其中磷酸氢二钾是一种磷酸盐类，具有缓冲的作用，能防止培养基pH的急剧变化。,（,四,）,生长素,：,生长素对菌丝体代谢活动有刺激作用。一般天然物质如马铃薯、麦芽汁、麸皮、米糠中均含有丰富的生长素，无需另行添加；B族维生素是菌丝体生长发育所必需的维生素，,配制培养基时，加入少量的B族维生素如维生素B1等，对菌丝生长有良好的作用,。,（,五,）,水分,：,水是微生物生长所必不可少的。水不仅是菌丝细胞原生质的主要成分，且菌丝体的一切生理活动都需在有水的情况下进行。水参与细胞内一系列化学反应，起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素。因此，,在配制各种培养基时，应加入一定量的水分。,（,六,）,凝固剂,：,配制培养基常用的凝固剂为琼脂,，又名洋菜，是有是石花菜等藻类提取的一种多糖，本身没有营养，主要起凝固作用，约96时熔化，40时凝固，常用浓度为1.8%2%。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,1、配方,马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（简称PDA培养基）,：马铃薯（去皮）200g，琼脂 1820g，葡萄糖20g，水1 000ml。也可以用蔗糖20g取代葡萄糖即为PGA培养基。,广泛适用于分离、培养、保藏各种药用真菌。最常用的母种培养基。其他的培养基可参考附录1常见的培养基配方。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,2、培养基主要成分的理化性质与制备方法,（1）琼脂,理化性状：熔点为96、凝固点40、微酸性，含水量16、灰分（干重）44、氧化钙115、氧化镁0.77、氮0.4，其凝固点较高，含氮量低，凝固后又可熔化，配成的培养基比较硬，保水能力好，不易于燥，是很好的凝固剂。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,2、培养基主要成分的理化性质与制备方法,（1）琼脂,虽然它不是绝对纯无营养的物质，但一般不能作为真菌的碳源，在没有添加营养物质的纯水琼脂培养墓上，真菌菌丝不能生长，只适于单孢子的分离，适宜进行药用真菌生理研究培养基的凝固剂。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,2、培养基主要成分的理化性质与制备方法,（1）琼脂,为了减少灭菌加热时培养基产生沉淀物，配出比较澄清的培养基，琼脂使用前应用蒸馏水洗涤，以减少无机盐和可溶性有机物的含量。如果将450g干琼脂，加水5000ml和吡啶500ml（可溶解许多有机和无机物质），20h后滤去液体，用蒸馏水洗3次，再用95酒精浸泡一夜后滤去酒精、晾干，则能得到更洁净的琼脂。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,2、培养基主要成分的理化性质与制备方法,（2）谷物、植物块茎、根茎、木材、树皮浸出液的制备：,马铃薯：,是制备培养基常用的材料，应先去皮；发芽的薯块芽眼处含有有毒的龙葵碱，应挖去芽眼，切块洗净后称重，加水煮沸，一般半小时，应软而不烂，用预先浸湿的8层纱布过滤，方可使用。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,2、培养基主要成分的理化性质与制备方法,（2）谷物、植物块茎、根茎、木材、树皮浸出液的制备：,甘薯也常用作培养基，其制作方法与马铃薯相同。但应选择完好无病的薯块作培养基，甘薯块根在贮藏期间，其伤口处最容易感染黑斑病，用病薯作培养基，虽挖去病斑，高压灭菌后也很难杀厚垣孢子，会引起培养基真菌性污染。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,2、培养基主要成分的理化性质与制备方法,（2）谷物、植物块茎、根茎、木材、树皮浸出液的制备：,木材作培养基应选择幼嫩枝条或边材，切成小块或粉碎后称重；植物块茎、根茎作培养基时先在清水中洗净，削去外皮后称重，加适量的水煮沸1015min，谷物种子洗净后应先浸泡，然后煮沸12h，趁热用双层纱布过滤，补充水量后即为浸出液。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,3、制备方法,（1）按配方精确称取各种营养物质。,（2）马铃薯等块茎、植物根去皮后切块洗净，加水1 000 ml，文火煮沸30 min后过滤取汁；玉米粉称重后加水1 000 ml，加热到70左右，保持60 min，过滤取汁；麦芽称重后加水1 000 ml，加热至60左右，保持60 min，过滤取汁，最后补足水量至1 000 ml。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,3、制备方法,（,3）酸碱度调整：根据不同药用真菌的要求，用稀碱（1molL NaOH）稀酸（1molLHCl）来调整酸碱度至适度为止。,（4）将称好的琼脂，加入上述配好的液体培养基中，边加热边搅拌，待琼脂完全熔化后，用湿纱布迅速过滤，趁热进行分装。,三,、培养基,的配制,（一）母种培养基,3、制备方法,（4）分装注意事项：,分装仪器玻璃漏斗；,分装装量控制：,棉塞的制备：,灭菌：蒸汽压力1.2 kgcm2，温度达121，保持30 min。,摆斜面：长度不超过试管的1/2,三,、培养基,的配制,（二）原种和栽培种培养基,1、培养料的选择与处理,药用真菌栽培的原料基质可分为主要原料和辅助原料。,主要原料有工农林业副产物、禽畜粪便、野草和树枝以及药用真菌栽培废料等，简称为主料。它们富含纤维素、半纤维素和木质素等有机物，是药用真菌生长的主要营养源。阔叶树木屑、酒糟、棉籽壳、花生壳、废棉、树叶、作物秸秆、玉米芯、甘蔗渣、木制品下脚料等为主料，再添加适当的辅助材料后均可用于栽培药用真菌。,三,、培养基,的配制,（二）原种和栽培种培养基,1、培养料的选择与处理