资源描述
实 验 四,酵母,RNA,的分离及其组分鉴定,（ 离 心 技 术 ）,实验目的,1,、学习稀碱法提取酵母,RNA,粗制品的原理和方法。,2,、了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。,3,、学习离心机的使用方法。,离心机原理和应用,离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开 。,rpm, revolutions per minute,每分钟转数,RCF,- Relative centrifugal force,相对离心力，是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力加速度,g,的倍数,4000,rpm,4000,g,RCF,= 1.11910,5(,rpm,)2 r,其中,r,表示离心机转轴中心,与,离心管中心的距离单位为,cm,。由于离心管的位置由转子（,rotor,）决定，因此,r,必须由查阅相关转子的参数而得。,使用注意：配平！,离心参数调节：转头，转速和离心时间,核糖核酸,（,Ribonucleic acid,，,RNA,）,由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名。,RNA,的种类：,mRNA,，,tRNA,和,rRNA,，另外,snRNA,（,2006,年诺贝尔医学奖）。,核苷,-5,-,磷酸,酵母细胞富含核酸，且核酸主要是,RNA,，含量为干菌体的,2.67%-10.0%,，而,DNA,含量仅为,0.03%-0.516%,。,工业上制备,RNA,多选用成本低、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的,RNA,，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。,应用领域：调味品和食品添加剂,实验原理,稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，离心除去蛋白质和菌体后，上清液用乙醇使,RNA,沉淀，由此即得到,RNA,粗制品。,RNA,含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以鉴定上述的组分。,RNA,组份鉴定,（,1,）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。,（,2,）苔衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与苔衣酚（,3,，,5-,二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。,（,3,）磷酸与定磷试剂中的钼酸铵作用生成磷钼酸，并被,Vc,还原成蓝色的的复合物钼蓝。,实验仪器,1.,研钵,2.,水浴锅,3.,量筒,4.,滴管,5.,试管及试管架,6.,烧杯,7.,离心机,8.,锥形瓶,试剂和材料,1. 0.04mol/L,氢氧化钠溶液,6.,定磷试剂,2.,三氯化铁浓盐酸溶液,7.,酸性乙醇溶液,3. 0.1mol/L,硝酸银溶液,8.,苔黑酚乙醇溶液,4. 1.5mol/L,硫酸溶液,9.,酵母粉,5.,浓氨水,操作步骤,（一）酵母,RNA,粗制品的提取,1,、将酵母片在研钵中研磨均匀，称取,4g,酵母粉悬于,30mL 0.04mol/L,NaOH,溶液中,(,锥形瓶,),。在沸水浴上加热,30,分钟后，冷却。,2,、,4000r/min,离心,5,分钟后，分成上清和沉淀两层，沉淀主要成分就是变性的蛋白质，,RNA,包含在上清中。,3,、将上清液缓缓倾入,30,mL,酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（,4000rpm,）,5,分,钟。弃去上清液。,注：离心前，离心管（包含转头）一定要对称的两管在天平上配平，第一次用,NaOH,溶液，第二次用酸性乙醇,。,两次使用的胶头滴管要分开放置,（二）组分鉴定,1,、水解：提取的核酸溶解于,10,mL 1.5mol/L,硫酸溶液中，在沸水浴中加热,10min,制成水解液，进行组分的鉴定 。,2.,嘌呤碱：取一只试管，加入,1ml,水解液，加入,过量,的浓氨水（用胶头吸管吸,2,管约,2ml,），再加入,1 ml 0.1 mol/L,硝酸银，观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀生成。,嘌呤银络合物在碱性条件下易形成白色絮状沉淀。,3.,核糖：取一只试管，加入水解液,1ml,，三氯化铁浓盐酸溶液,2ml,，加入苔黑酚乙醇溶液,0.2ml,，放入沸水浴中,5min,。注意溶液是否变墨绿色。,核糖在浓盐酸中，与苔黑酚（,3,，,5-,二羟甲苯）及三氯化铁盐酸试剂共热，产生绿色的络合物。,4.,磷酸：取一只试管，加入水解液,1ml,和定磷试剂,1ml,，在沸水浴中加热。观察溶液是否变成蓝色。,磷酸与钼酸铵试剂作用产生磷钼酸，磷钼酸在还原剂抗坏血酸,(,Vc,),的作用下形成蓝色复合物钼蓝。,1.,稀碱法提取的,RNA,为变性,RNA,，可用于,RNA,组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为,RNA,生物活性实验材料。,2.,苔黑酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为,RNA,与,DNA,鉴别的依据。,。,3.,试剂瓶中溶液用胶头滴管取用，吸,1,管约为,1,毫升，,0.2ml,用胶头滴管取,4,滴即可（每滴约为,0.05,毫升），,4.,离心：两组配平,5.,请将试剂瓶放在原处取用，以免其他同学不能找到。,注意事项,强酸 、强碱、 沸水浴，注意安全！,下次实验：,蛋白质含量测定（考马斯亮蓝,G-250,法）,
展开阅读全文