流感病毒实验室检测

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,流感病毒实验室检测技术,及盲样考核结果分析,湖南省疾病预防控制中心,微生物检验科,黄一伟,2013-12-27,流感监测目的,（一）监测流感活动水平和流行动态；,（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；,（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。,流感监测内容,（一）流感样病例监测,（二）流感样病例暴发疫情监测,流感样病例监测标本采集,采集对象：,流感样病例,发热（体温,38,），伴咳嗽或咽痛之一者,采集时间：病人发病的头,3,天内采集,采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院,采集数量：根据就诊,ILI,病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集,5,15,份流感样病例的标本,(,根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时调整,）,暴发疫情标本采集,（,1,）,1,周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生,30,例及以上流感样病例；或发生,5,例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生,2,例及以上有流行病学关联的死亡病例；,（,2,）在某一社区内（如同一乡或街道）,1,周内出现流感样病例异常增多。,每一起暴发疫情一般应当采集,10,份左右咽、鼻拭子标本（如果现症病例在,10,例以下的，应当尽量全部采样）。,采集标本类型,常规,特殊,咽拭子,鼻咽,/,呼吸道吸取物,鼻拭子,鼻洗液,痰液 呼吸道灌洗液,肺组织活检标本,尸检标本,采样液,常用的采样液有：的,Hanks,液或,MEM,；,标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素,50 mg/mL,，多粘菌素,B 250,g/mL,）,咽拭子采集,咽拭子,用灭菌棉签（,最好用,聚丙烯纤维头的塑料杆拭子,）擦拭,双侧咽扁桃体及咽后壁,，将棉签头部浸入含,3-4ml,采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。,标本的保存与运送,标本采集后应在,4,条件下，尽快（哨点监测,48,小时疫情,24,小时内）运送至流感监测网络实验室,未能送至实验室的，应置,-70,或以下保存，一周内送实验室,冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷藏条件下送到实验室,实验室生物安全要求,季节性流感病毒分离鉴定在生物安全,级实验室进行。,流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全,级实验室的生物安全柜里操作。,用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全,级实验室进行,标本的接收,接收标本时必须核对送检表,流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，,24,小时内将“流感,/,人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表,2,）录入到“监测信息系统”,标本的处理,标本送至实验室后，立即进行处理，未加抗菌素的加入适量的抗菌素。,将原始标本,一分为三份,，一份（,1ml,）用于,MDCK,细胞接种，一份（,1ml,）用于鸡胚接种，一份（,1ml,）保存待复核。,（根据检测程序实时调整）,实验室检测,核酸检测,病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养,胶体金快速检测,检测流程,临床标本采集,接种,MDCK,细胞,接种鸡胚,红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒,红细胞凝集试验,寄送国家流感中心,流感病毒核酸检测阳性,核酸检测,核酸提取,- QIAamp Viral RNA Mini Kit,1,）在,1.5ml,离心管中加入,AVL,（病毒裂解液）,560ul,。,2,）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）,140ul,加入上述离心管中（粪便标本用,10,悬液的上清），震荡,15s,，室温放置,10min,。,3,）稍离心后，加入,560ul,无水乙醇，震荡,15s,。,4,）将,Viral RNA Mini spin,柱子取出，将步骤,3,的混合液吸取,630ul,加入柱子中，,8000rpm,离心,1min,。弃离心液。,5,）重复步骤,4,。,6,）将吸附柱放入一新的,2ml,套管中，加入,500ul AW l,液，,8000 rpm,离心,1min,。弃套管及其离心液。,7,）将吸附柱放入一新的,2ml,套管中，加入,500ul AW 2,液，,13000rpm,离心,3min,，弃套管及其离心液。,8,）将吸附柱放入一新的,1.5ml,离心管中，于柱中加入,60ul,的,AVE,液，室温静置,1,3,分钟，,8000rpm,离心,1min,，收集离心液即为提取的病毒,RNA,，立即实验或,20,以下保存。,荧光定量,PCR,第一次使用前引物稀释,1,引物工作浓度（,40M,）,配制方法：,（,1,）将新合成的引物开盖前短暂离心（,12000rpm,，,15s,）。,（,2,）用,RNase Free Water,溶解，加水量为,10,总摩尔数,，充分混匀，此时引物浓度为,100M,，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管,2OD,，若,2OD,的量为,9.1 nmol,，加水量为,91l,）,（,3,）将,100M,的引物倍稀释，此时浓度为,40M,，可作为工作浓度。,2,探针工作浓度（,10/20M/,）,配制方法：,（,1,）将新合成的探针管开盖前短暂离心（,12000rpm,，,15s,）。,（,2,）用,RNase Free Water,溶解，加水量为,10,总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为,100M,，可作为储存液。,（,3,）将,100M,的探针,10/5,倍稀释，此时浓度为,10/20M,，可作为工作浓度。,荧光定量,PCR,引物和探针,稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光,2-8,可保存多达,3,个月，不要对探针反复冻融）；,涡旋振荡引物和探针；,瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。,real-time RT-PCR,的试剂,QIAGEN,公司,QuantiTect Probe RT-PCR Kit,，,Cat No. 204443,注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。,荧光定量,PCR,反应体系和条件,试剂：,Invitrogen SuperScript,III Platinum,One-Step Quantitative Kit,（公司：,Invitrogen,，货号：,11732-020,或,11745-100,）,分子级无菌蒸馏水,(,无,RNA,酶和,DNA,酶,),正反向引物,(40M),双重标记探针,(10M),反应条件：逆转录,50 30min95 2min ,（,95 15s 55 30s*,）,45,反应体系为,25ul,注：*在,55,度这一步骤中要收集荧光信号（,FAM,）,荧光,PCR,结果阳性样品,荧光,PCR,结果阴性样品,荧光,PCR,结果可疑样品,病毒分离,-MDCK,细胞,标本接种,MDCK,细胞,每日观察细胞病变,(CPE),MDCK,细胞收获,33,35,培养,接种流程,清洗,MDCK,细胞,临床采样标本接种细胞,Hank,s,液清洗细胞，一般清洗,2,遍,33,35,度吸附,1,2,小时,Hank,s,液清洗细胞,加入病毒生长液，,33,35,度培养箱培养,24,小时后，观察细胞病变。当细胞病变为,3+,或,4+,时，即,75,100%,细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融,1,2,次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第,7,天收获 （,细胞病变情况：细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落,）,根据使用的细胞瓶的大小，决定接种量，一般的小细胞瓶接种的临床标本,流程图,MDCK,细胞病毒分离,CPE,出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和,MDCK,细胞的敏感性有关,每日观察细胞病变,(CPE),标本接种后,7,天还未出现,CPE,，维持液经,HA,试验阴性者，继续盲传,1,2,代后，,HA,试验仍为阴性者，则,MDCK,细胞病毒分离为阴性，标本可弃去,细胞病变图,鸡胚病毒分离,标本接种于,9,日龄鸡胚,33,35,培养,72,小时,检卵,标本准备,鸡胚分离方法,-,试剂准备,1) 9,11,日龄鸡胚,2),照蛋灯,3) 70%,75,酒精,4) 1ml,一次性注射器,5),鸡蛋开孔器,6),无菌胶布或蜡,7) 10ml,试管和试管架,8) 10ml,移液管或,1ml,移液器及无菌吸尖,9),无菌镊子,10),无菌眼科剪,鸡胚分离方法,-,标记鸡胚,检视标记鸡胚,用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态,血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块,胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动,绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限,标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置,如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉,接种病毒方法,单腔接种,盲种,双腔接种 灯下接种,开窗接种,鸡胚分离方法,鸡胚分离流程（,1,）,将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种,3,个鸡胚,用,70%,75,酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开,10x6mm,窗口,用注射器吸,200l,处理过的临床标本，装上,16,号针头,从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射,100l,标本。将针头退出至,寸，将另外,100 l,标本 注入鸡胚尿囊腔,鸡胚分离流程（,2,）,用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚,将针头弃于合适的生物安全装置中,用消毒过的医用胶布封口,33,35,o,C,温箱培养鸡胚,2,3,天。临床采样标本通常培养,3,天，病毒传代通常培养,2,天,鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，,24,小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去,鸡胚分离流程（,3,）,收获尿囊液和羊水,鸡胚在收获前应,4,过夜或至少放置,4,小时,标记,15ml,无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致,用,70%,75,酒精消毒鸡胚顶部,用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用,10ml,吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将,3,个鸡胚的羊水合并,鸡胚病毒鉴定,经,HA,试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传,1,代（,72,小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去,鸡胚收获,HA,试验,病毒鉴定,红细胞凝集,红细胞凝集抑制试验,病毒鉴定流程,红细胞凝集试验,4,个凝集单位配制“回滴”,红细胞凝集抑制试验,判定流感病毒型别,红细胞凝集试验（,HA,）,MDCK,细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（,HA,），确定病毒滴度,原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白,（,HA,）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现,红细胞,鸡,火鸡,豚鼠,人,O,型血红细胞,马,适用范围,流感和禽流感病毒,流感和禽流感病毒,流感病毒,流感病毒,禽流感病毒,终浓度（）,0.5,（,1%,）,0.5,（,1%,）,0.,75,（,1.5%,）,/0.5,（,1%,）,0.75,（,1.5%,）,/0.5,（,1%,）,0.5,（,1%,）,孔底部形状,U,或,V,型,U,或,V,型,U,型,U,型,U,型,孵育时间,30min,30min,45min,45min,60min,细胞对照,细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状,细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状,细胞沉积成环状,细胞沉积成环状,细胞沉积成环状,A,H,B,C,D,E,F,G,100ul,病毒液,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,稀释完病毒液后加入,50ul,红细胞悬液,50ulPBS,稀释病毒,加入配制好的红细胞悬液,充分混匀，置室温孵育,30-60,分钟,观察记录结果,病毒,原液,1,：,2,1,：,128,HA,：,32,HA,128,HA,：,4,红细胞凝集试验（,HA,）,HA,滴度,8,，进行红细胞凝集抑制（,HI,）试验；,HA,滴度,8,者，继续在敏感的,MDCK,细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其,HA,滴度,8,后，再进行,HI,测定,若传,1,2,代后，,HA,滴度仍,8,者，可应用核酸检测方法进行鉴定,红细胞凝集抑制（,HI,）试验,HA,试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗,A,（,H1N1,）、抗,A,（,H3N2,）、抗,B,（,Victoria,系）和抗,B,（,Yamagata,系）,4,种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（,HI,）试验，确定病毒的型别和亚型，进行,HI,试验时，需同时进行,4,种标准抗原对照。,红细胞凝集抑制试验步骤,4,个凝集单位的配制和检测,稀释血清,加入,25ul 4,个血凝单位抗原，室温孵育,15-30,分钟,每孔加入,50ul,红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育,30-60,分钟,观察记录结果,4,个凝集单位的配制和检测,4,个凝集单位的配制,读取红细胞凝集试验的结果,计算所须的,4,个凝集单位的病毒用量,用,50ul,检测,4,个凝集单位时，用凝集效价除以,8,，所得商即为,4,个单位的稀释度,用红细胞凝集试验“回滴”，复核,4,个凝集单位,用,50ul,，前,4,孔完全凝集 。此时的抗原即为,4,个凝集单位,红细胞凝集抑制试验稀释血清,1,2,7,6,5,3,4,9,8,10,H1,血清,50ul,H3,血清,50ul,50ul,PBS,B,血清,50ul,25ul,PBS,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,B,血清,50ul,H3,血清,50ul,H1,血清,50ul,流感病毒的型别判定,标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价,20,才可以算为阳性,一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制,待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清,4,倍以上时，可以判定为此型别的流感病毒,红细胞凝集抑制试验,-,质量控制,使用的试剂可靠无误,处理后的血清有无残余非特异性凝集素,读取,HA,试验的结果是否正确,4,个血凝单位是否准确,红细胞阴性对照,待鉴定病毒确保没有被细菌污染,稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确,结果录入,流感监测网络实验室的工作人员在完成病毒分离后，,24,小时内将病毒分离结果录入“监测信息系统”中的“病毒分离、鉴定结果登记一览表” 中 。,毒株的送检,系统自动生产的送检单，省里和国家均送检,时限要求,包装要求,省级参比中心,开始启动,9,个（,30%,）省级,CDC,建成省级流感参比中心,80 %,网络实验室开展病毒分离,2009-2013,年度全国网络实验室工作开展情况,80.1%,2010-2013,年度全国网络实验室盲样考核情况,97.5%,93.2%,96.0%,2010-2013,年度全国网络实验室标本检测结果,省级流感参比中心工作要求,省级流感参比中心工作要求,参比中心近期要求,成为参比中心,4,年内，所有流感网络实验室均具备病毒分离能力，并上送毒株,省参比中心的毒株复核鉴定工作,各实验室毒株在网上送检时需要多点一下送省里,毒株,国家流感中心,省,CDC,10,个工作日内完成复核鉴定,滴度,8,的型别鉴定，滴度,8,核酸鉴定，每周一在系统中反馈结果,质控考核,-,考核标本,考核标本制备：,14,份,H1N1,，,14,份,H3N2,，,14,份,BV,，,10,份,H5N1,，,7,份,H7N9,，,10,份阴性,7,份,BY,和,H3N2,混合型,4,份,H1N1,，,H3N2,，,BY,混合型,每个地市随机抽取,5,份标本,质控考核,-,新的要求,增加混合型,B,型要求分系,考虑到运输问题，均为强阳性,质控考核,-,结果,14,家网络实验室结果全部正确,一些问题：,原始记录应为手写，而非全部打印,+,签名,原始记录空白项、涂改项,有一地市为非正式的报告单，报告人未签名，报告处未盖章,祝各位代表,工作顺利、生活愉快！,