肠杆菌科细菌碳青霉烯类抗生素耐药机制研究进展

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肠杆菌科细菌碳青霉烯类抗生素耐药机制研究进展,浙江大学医学院附属第一 医院,俞云松,专题报告,碳青霉烯类抗生素临床地位非常重要,超广谱,-,内酰胺酶（,ESBLs）,稳定,头孢菌素酶（,AmpC,酶）稳定,青霉素结合蛋白(,PBPs),高亲和力,能够有效渗透细菌外膜进入周质间隙,目前临床上控制革兰阴性菌感染最 有效的抗菌药物,对碳青霉烯类抗生素耐药机制,外膜孔蛋白减少或丢失,碳青霉烯酶的产生,主动泵出系统过度表达,青霉素结合蛋白的改变,是指所有能明显水解亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗生素的,内酰胺酶。,碳青霉烯酶,天然来源碳青霉烯酶,嗜麦芽寡养单胞菌的,L1,酶,获得性碳青霉烯酶,（,Ambler,分子分类）,B,类,酶,（,金属酶）：,IMP、VIM,类及,SPM-1,A,类酶：,NMC-A,、KPC-1、GES-2,等,D,类酶：,OXA-23,至,OXA-27、40、48、54,碳青霉烯酶按其来源可分为,能水解包括,碳青霉烯类（,Carbapenems）,在内,-,内酰胺类抗生素,（氨曲南例外）,不被酶抑制剂克拉维酸等所抑制,IMP,、VIM,类为最主要的类型,能被,EDTA、,巯基丙酸抑制,B,类为金属酶，在,Bush,分群中为第三组:,NMC-A、,Sme,-1,到,Sme,-3、IMI-1,酶（阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌产生）,KPC-1、2，GES-2,酶（肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌产生，都是青霉素酶，可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药，,不能水解第三代头孢菌素,（,GES-2,除外）,A,类中的碳青霉烯酶为丝氨酸酶，,属于,Bush,分类中的2,f,亚群：,目前已发现9种（,OXA-23OXA-27、40、48、49、54）,对碳青霉烯类和广谱头孢菌素水解作用相对较弱，常合并膜通透性的下降,D,类酶主要见于不动杆菌,碳青霉烯酶的地域分布,(1),IMP-1 B,铜绿假单胞菌、沙雷菌、 日本(1991)、新加坡、韩国,克雷伯菌、鲍曼不动杆菌,IMP-2 B,鲍曼不动杆菌 意大利(2000),IMP-3 B,福氏志贺菌 日本(2000),IMP-4 B,不动杆菌 香港(2001),IMP-5 B,鲍曼不动杆菌 葡萄牙,IMP-6 B,粘质沙雷菌 日本(2001),IMP-7 B,铜绿假单胞菌 加拿大(2002),IMP-8 B,肺炎克雷伯菌 台湾(2001),IMP-9 B,铜绿假单胞菌 中国(2001),IMP-10 B,铜绿假单胞菌 日本(2002),木糖氧化产碱杆菌,IMP-11 B,铜绿假单胞菌 日本（2001）,鲍曼不动杆菌,IMP-12 B,恶臭假单胞菌 意大利(2003),IMP-13 B,铜绿假单胞菌 意大利(2001),酶 分类 产生的菌属 发现的地区(首次报道的年代),碳青霉烯酶的地域分布,VIM-1 B,铜绿假单胞菌 意大利(1999)、希腊,VIM-2 B,铜绿假单胞菌、不动杆菌 法国(2000)、韩国,VIM-3 B,铜绿假单胞菌 台湾(2001),VIM-4 B,铜绿假单胞菌、不动杆菌 法国(2000)、韩国,VIM-5 B,肺炎克雷伯菌 土耳其（2002）,VIM-6 B,恶臭假单胞菌 新加坡(2002),VIM-7 B,铜绿假单胞菌 北美(2004),SPM-1 B,铜绿假单胞菌 巴西,(2002,),OXA-23/27 D,不动杆菌 英国(2000)、 新加坡、巴西,OXA-24/25/26 D,不动杆菌 西班牙(2000)、比利时,OXA-40 D,鲍曼不动杆菌 法国(2002),OXA-48 D,肺炎克雷伯菌 法国(2004),OXA-49 D,鲍曼不动杆菌 中国(2003),OXA-54 D,希瓦菌 法国(2002),（,Shewanella oneidensis),Sme-1/2/3 A,粘质沙雷菌 英国(1990) 、美国,IMI-1、NMC-A A,阴沟肠杆菌 法国(1996)、美国,KPC-1 A,肠炎沙门菌、肺炎克雷伯菌 希腊、美国,GES 2 A,铜绿假单胞菌 法国,酶 分类 产生的菌属 发现的地区(首次报道的年代),目前碳青霉烯抗生素耐药主要见于,非发酵菌,，近年,随着临床应用的增加，在肠杆菌科细菌也出现对亚胺培南耐药的菌株,肠杆菌科细菌碳青霉烯类抗生素耐药的原因,碳青霉烯酶的产生,外膜蛋白的缺失或数量的减少伴有高水平,-,内酰胺酶的持续产生,药物作用靶位的改变，主要是青霉素结合蛋白,PBP,的改变,一、 碳青霉烯酶的产生,在肠杆菌科细菌中，,A,类,、,B,类,和,D,类,酶均有报道。,A,类碳青霉烯酶,主要有阴沟肠杆菌中的,NMC-A,、,IMI-1,和粘质沙雷菌,Sme,-1,3,，,由,染色体介导,肺炎克雷伯菌中由,质粒介导,的,KPC-1,、,KPC-2,肠杆菌科,A,类碳青霉烯酶的特性,不水解三代头孢菌素,IMI-1,、,NMC-A,、KPC-1 、 KPC-2,能被,克拉维酸,所抑制，而,Sme-1,3,不能被,克拉维酸,抑制,均不被,EDTA,所抑制,Nmc-A,是第一个发现的碳青霉烯酶，,1990,年法国巴黎一位外伤病人身上分离到能产,NMC-A,的阴沟肠杆菌,Nmc-A,的产生可被头孢菌素和碳青霉烯类抗生素所诱导,正性调节蛋白,NmcR,编码序列位于开放阅读框的上游，其调控蛋白类似于,AmpR,的调节,Imi-1,来自阴沟肠杆菌，生化特性和酶动力参数类似于,NMC-A,易被三唑巴坦所抑制,，水解头孢噻肟和头孢他啶能力较弱,Sme-1,3,来自粘质沙雷菌不被克拉维酸抑制,对碳青霉烯类抗生素水解作用较弱（可能与其缺乏,SD,序列即核糖体结合位点,有关）,Sme,的调控蛋白为,Sme-R,，,其调控类似,NMC-A,、,AmpC.,KPC-1,、,KPC-2,均来自,肺炎克雷伯菌，不被抗生素所诱导，易被克拉维酸和三唑巴坦所抑制，水解碳青霉烯类抗生素的能力较弱，其编码基因位于大小,约,50,KB,的非结合性质粒上,Antibiotic,MIC(mg/l),E coli JM109,Ecoli,JM109,E coli DH5a,E coli DH5a,Sme-,1,NMC-A,IMI-1,KPC-1,Ampicillin,1024,1024,32,64,Cefotaxime,0.25,0.25,2,16,Ceftazidime,1,1,8,8,Imipenem,32,32,32,8,Meropenem,2,2,32,4,Aztreonam,64,64,ND,64,Piperacillin,ND,ND,128,ND,Piperacillin-tazobactam,ND,ND,128,ND,Ticarcillin,ND,1024,128,ND,Ticarcillin-clavulanic acid,ND,512,128,ND,Cefoxitin,ND,ND,16,16,Ceftriaxone,ND,ND,16,32,肠杆菌科四种产,A,类碳青霉烯酶纯化菌株的,MIC,值,肠杆菌科最新报道的,碳青霉烯酶,SFC-1,葡萄牙首先在,居泉沙雷菌(,Serratia fonticola,）,中发现，,能水解,碳青霉烯类抗生素,编码基因位于,染色体,上，（,Antimicrob,Agents,Chemother,.2004 Jun;48(6):2321-2324）,GES-3,来自大肠埃希菌,GES-4,来自肺炎克雷伯菌,均由,GES-1,点突变而来,编码基因均位于,I,类整合子上,希腊首先报道（,FEMS,Microbiol Lett,. 2004 May 15;234(2):209-13）,.,B,类酶（金属酶）,在肠杆菌科中大多数由,质粒介导,主要有,IMP,和,VIM,类金属酶,IMP-1,首先在,粘质沙雷菌,分离到，其编码基因可以在染色体上,也可位于,可转移的,大质粒上,，并不是所有,IMP-1,的菌株都表达对碳青霉烯类抗生素的高水平水解活性，这可能与沉默型基因存在有关,IMP-3,2000,年日本从福氏志贺菌分离到，其编码基因位于,接合性质粒上的,I,类整合子,中,，,对苯唑西林、氨苄西林、头孢他啶、亚胺培南水解活性较弱,IMP-6,1996,年日本粘质沙雷菌中首先发现,，,由,质粒介导,，与,IMP-1,相比，196位的丝氨酸突变成甘氨酸,，,对美罗培南、帕尼培南水解能力强，而对亚胺培南，青霉素，哌拉西林水解能力较弱,。,IMP-8,首先由台湾,YAN,等人从一株多重耐药的肺炎克雷伯菌分离到，由,质粒介导,，与,IMP-2,相比，其中4个碱基突变引起2个氨基酸的改变，61位由,GC，62,位由,CG,使21位氨基酸由精氨酸丙氨酸，617位由,GT，,导致216位氨基酸由缬氨酸甘氨酸,VIM,类金属酶,与,IMP,酶的同源性,32,0.38,32,Ciprofloxacin,0.064,0.25,0.25,Amikacin,4,2,2,Cefepime,2,0.064,0.064,Ceftazidime,16,0.5,0.38,Cefotaxime,12,0.05,0.125,Cefoperazone,256,0.5,1.5,Cefoperazone/Sulbactam,128,0.25,2,Piperacillin/Tazobactam,256,2,4,Ticarcilliin/Clavulanic Acid,256,12,32,Ampicillin/Sulbactam,256,8,64,11,种抗菌药物对阴沟肠杆菌、,EC600,、,接合菌的最小抑菌浓度,阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱,M,1,A B M,2,54,kb,15,kb,质粒,DNA,与,PCR,产物探针的,Southern,杂交,A B,新的质粒介导的,IMI-1,功能基因核苷酸及氨基酸序列分析,载体,质粒,克隆表达的构建示意图,Pst I,EcoR I,接合菌质粒经,Pst I,酶切克隆筛选后获的片断,10,插入片断,3,kb,载体片断,kb,10,KB,插入片断经,BamH1,酶切克隆筛选获得片断,5,kb,载体片断,插入片断,IMI-1,调控蛋白,Imi-1,ISEhe3,质粒介导的,Imi-1,碳青霉烯酶的传播机制,TTTTTGAGTTTAAACAATACAACTCAAATGAGTAAAAACATCTATGATAAAGACATTATTTACTTATATATGTGTTATTTCATTAA,GTAATAACTGAATCGCCACGAG,TTTAACAGACACCTCAGAGCCATTTAAGAGGACTTAAAAGAGAGGTGCCCATTAGCGGTAAGCGTTATCCCGAAGAGTTTAAAATTGAAGCAGTCAAACAGGTTGTTGATCGTGGTCATTCTGTTTCCAGCGTTGCAACACGTCTCGATATCACCACCCACAGCCTTTACGCCTGGATAAAGAAGTACGGTCCGGATTCTTCCATTAATAAAGAACAGTCAGATGCTCAGGCCGAGATCCGCCGTCTCCAGAACGAGCTGAAGCGGGTTACCGACGGACGGGACATATTAAAAAAAGCCGCGGCGTACTTCGCAAAGCTGTCCGACTGAGGTACGCCTTTATCCGTGACAACACTTTTTGCGGCCTGTTCGCCTGCTCTGTCGGGTGCTGGATGTTCATCCGGGTGGCTTTTACGCCTGGCTTCAGCAGCCGCATTCACAACGCCATCAGGCAGACCTGAGACTGACAGGACAGATAAAACAGTTCTGGCTGGAATCGGGATGCGTCTATGGTTATCGCAAGATCTATCTGAAGCTGCGGGACAGCGGGCAACAGTGCGGAGTCAACAGAGTCTGGCGACTGATGAAACGTGTCGGGATAAAGGCTCAGGTCGGGTACCGGAGCCCGCGGGCACGTAAAGGCGAGGCCAGTATTGTGTCGCCCAACAGGCTCCGGCGGCAGTTCAATTCGGATGCTCCGGATGAGCGTTGGGTAACGGACATAACCTACATCAGGACCCACGAAGGTTGGTTGTATCTGGCCGTGGTTGTTGATCTGTTCTCACGCAAAATTATCGGCTGGTCCATGCAATCCCGGATGACAAAGGACATTGTCCTGAACGCACTGCTGATGGCTGTATGGCGGCGTAATCCCGAAAAACAGGTGCTGGTTCATTCGGATCAGGGCAGTCAGTACACAAGCCATGAGTGGCAGTCGTTCCTGAAATCACACGGCCTGGAGGGTAGCATGAGCCGTCGCGGTAACTGCCATGATAATGCGGTTGCAGAAAGTTTTTTCCAGTTGTTGAAACGTGAACGGATAAAGAAAAAGATCTACGGAACGCGGGAAGAAGCCCGCAGTGATATTTTTGATTACATCGAAATGTTTTATAACAGTAAGCGTCGGCATGGTTCTAGCGAACAGATGTCACCGACAGAATATGAAAACCAGTATTATCAACGGCTCGGAAGTGTCTAGATTATC,CGTGGCGATTCAAACATTG,CAGCATATAGCTGCTTACGTTCATGCAAGTCATAGACAGAAGAAAATATTTTGCTACCATGAGATAAGTTTACTCACCTACCTATTTACTCATTTATTCCTTTACTTATTTGAGTGCCCGCGCCAAGTTTAAAATGTTAAGGATTAATGACCCGCTGCTTTATCACCCATCATGTGCCCACTCATT,ISEhe3,插入序列,脉冲场凝胶电泳,染色体,DNA,的制备,Sma,酶切,加样及电泳,EB,液染色，观察结果,3-4,h,25,o,C,14，6,v/cm，120,度,26,h，240s,Lysostaphin,图一 :,2、5泳道的条带完全一样，为同一克隆株，属于,A1,亚型;10泳道与,A1,相差2个条带， 属于,A2,亚型;1泳道与,A1,相差1个条带，属于,A3,亚型; 11泳道与,A1,相差1个条带，属于,A6,亚型; 4、7、8泳道的条带完全一样，为同一克隆株，属于,B1,亚型;6泳道为,C3,亚型;9泳道为,C4,亚型; 3泳道为,E,型; 12泳道为,F,型。,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112,kb,48.5,MRSA,MRSH,六株同时产,SHV-12、CTX-3,和,DHA-1,酶肺炎克雷伯菌同源性分析,产,VIM-2,金属酶铜绿假单胞菌同源性分析,邵逸夫医院和浙一医院部分耐药株,PFGE,结果,47-51为邵逸夫医院菌株，其余为浙一医院分耐药株，4851为同一 型(,D,型），47（,E,型）与浙一医院的41、43-46等,A2,型完全一致，42为,A4,亚型，16为,B,型，,M,为,Marker 。,51,50 49 48 47,M 46 45 44 43 42 41 16,谢谢！,