临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用,-,化学发光,-,荧光偏振,-,微粒子酶放大化学发光,电化学发光,-,时间分辨免疫荧光,抗体芯片,透射和散射比浊,流式细胞技术,-,免疫扩散,-,免疫沉淀,/,免疫凝集,- ELISA,- IFA,RIA,ICT,免疫学和自动化技术在临床免疫学诊断领域中的应用将大大加速,标记免疫学分析技术发展历程,免疫荧光分析,(Coons, 1941),放射免疫分析,(Berson,和,Yalow, 1960),酶联免疫吸附分析,(Engvall, 1971),金标免疫分析,(Faulk,和,Taylor, 1971),化学发光免疫分析,(Arakawa,，,1977),时间分辨荧光免疫分析,(Soini,和,Hemmila,，,1979),电化学发光免疫分析,(Leland, 1990),放射免疫诊断技术（,RIA,）,酶联免疫诊断技术（,ELISA,）,化学发光免疫诊断技术（,CLIA,）,20,世纪,60,年代,70,年代,80,年代,90,年代,2000,年,2020,年 时间,近代临床免疫诊断技术发展历程,临床免疫诊断技术的发展基本历经了以下三个阶段：,方法,中国,欧美,放射免疫法（,RIA,）,1.,兴起于,20,世纪,70,年代，现仍普遍使用于县级以上医院；,2.,产品处于衰退期；,3.,厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。,1.,兴起于,20,世纪,60,年代，现已基本退出临床应用；,2.,产品生命周期已终结；,3.,厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化,酶联免疫法（,ELISA,）,1.,兴起于,20,世纪,80,年代，现普遍使用于各级临床机构，为我国临床免疫诊断的基本方法；,2.,产品处于成熟期；,3.,厂商试剂和仪器共同开发，试剂尚未系列化。,1.,兴起于,20,世纪,70,年代，现仍在临床应用；,2.,产品处于衰退期；,3.,厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化。,化学发光免疫法（,CLIA,）,1.,导入于,20,世纪,90,年代，逐步进入各大中医院；,2.,产品处于快速成长期；,3.,正逐步实现,试剂和仪器共同开发，试剂逐步系列化,1.,兴起于,20,世纪,80,年代，现已被临床普遍使用，成为临床免疫诊断的支柱方法；,2.,产品处于成熟期；,3.,厂商试剂与仪器共同开发，仪器自动化程度高，试剂系列化状态好。,近代临床免疫诊断技术发展历程,技术成熟度高,放射性（,125,I,）污染和危害,125,I,的半衰期短，试剂有效期短,标记物,125,I,的稳定性差，批间、批内的变异较大,标准曲线有效期短，必须每次定标,操作繁琐，出报告时间长,无法保存备用。,放射免疫技术（,RIA,）,Rosalyn Yalow, 1977,成本低廉,定性、半定量和定量均可以检测,O.D,值在低中浓度范围与酶活性呈线性关系,可以肉眼简单判读或酶标仪准确判读结果,酶免疫分析技术,(EIA),灵敏度高，检测低限达,10,-19,mol,测定范围宽，可达,9,个数量级,自动化程度高，操作简单,试剂稳定性好，无污染有效期,6,24,月,化学发光免疫分析,（,CLIA,）,BAYER ACS 180,AxSYM,Elecsys 2010 System,Access 2 Immunoassay System,最先进的免疫学分析技术之一,非开放性试剂系统；,试剂价格过高,电化学发光免疫测定（,Electrochemiluminescence immunoassay, ECLI,）是电化学发光（,ECL,）和免疫测定相结合的产物。 它的标记物的发光原理与一般的化学发光（,CL,）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。,ECL,与,CL,的差异在于,ECL,是电启动发光反应，而,CL,是通过化合物混合启动发光反应。,Elecsys 2010 System,免疫学检验技术发展趋势,快速简便,精确灵敏,集成高通量,金标免疫层析检测,磁珠免疫层析检测,化学发光,时间分辨荧光,AlphaScreen,阵列芯片,液相悬浮芯片,化学发光免疫分析技术及其,在临床诊断中的应用,简史：本世纪,70,年代中期,Arakawe,首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。,原理：发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与催化的酶的量成正比,由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量,.,CLIA,试剂盒国产化程度已经较高，质量与国外产品的差距逐渐减小。,缺乏国产化的自动检测仪器,化学发光免疫分析发展史,CLIA,发光检测方法分类和对比,类型,原理,试剂,发光类型,化学发光免疫分析,(CLIA),化学发光物质直接标记抗原,(,体,),吖啶酯,异鲁米诺,闪光型,化学发光酶免疫分析,(CLEIA),在酶免疫分析完成后加入底物,鲁咪诺系统,AMPPD,系统,辉光型,电化学发光免疫分析（,ELCIA),电致化学发光与电化学手段相结合,三联吡啶钌三丙氨系统,闪光型,荧光免疫分析,根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体,）,荧光素,闪光型,【,化学发光免疫分析种类,】,1.,直接化学发光,A,吖啶酯发光,原理：,纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含,H,2,O,2,的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度,RLU,与待测抗原浓度成函数关系。,特点：,发光过程在,5,秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。,代表仪器：,拜耳公司的,ACS180,，雅培,Architect,。,原理图,【,化学发光免疫分析种类,】,B,异鲁米诺发光,原理：,发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在,3,秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。,代表仪器：,德国,Byk,Sangtec,公司的,LIAISON,原理图,2,、酶促化学发光或持久发光,原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶（,AP),或辣根过氧化物酶,(HRP),标记在抗体或抗原上，固相抗体或抗原与,AP,或,HRP,标记的抗原、抗体复合物在发光底物,AMPPD,或,Luminol,作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。,特点：,碱磷酶体系：水解反应，起光较慢，发光强度较弱，灵敏度 较高。,辣根酶体系：氧化还原反应，起光较快，发光强度较大。,代表仪器和试剂：,进口品牌：强生,VitrosECi,（鲁米喏），美国贝克曼公司的,ACCESS,（,AMPPD,） 。,国产主要厂家：郑州安图,（,HRP-LUMINOL),、北京源德,（,HRP-LUMINOL),、泰格可信,（,HRP-LUMINOL),、科美东雅,(AMPPD),、威海威高,（,HRP-LUMINOL),等,【,化学发光免疫分析种类,】,VitrosECi,（鲁米喏）,原理图,英国强生,VitrosECi,（鲁米喏）,3,、电化学发光,原理：,纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度,RLU,与待测抗原浓度成函数关系。,特点：,激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需,25,秒，测试速度慢。,代表仪器：,瑞士,ROCHE,公司的,ELECSYS 1010,和,ELECSYS 2010,。,【,化学发光免疫分析种类,】,电化学发光检测技术（,ELECSYS 1010 ELECSYS 2010,）,原理图,罗氏 （,Roche Diagnostics,）,1,结合了活化的三联吡啶钌衍生物即,Ru(bpy),3,2+,+ N,羟基琥珀酰胺酯（,NHS,）的抗,-HBs,和结合了生物素的抗,-HBs,与待测血清同时加入一个反应杯中孵育,9,分钟,操作步骤,将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育,9,分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、,抗,-HBs,连接为一体，形成双抗体夹心法,3,蠕动泵将形成的,Ru(bpy),3,2+,抗体抗原抗体磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的抗,-HBs,（与生物素结合的和与,Ru(bpy),3,2+,结合的抗体）也被吸出测量室,4,蠕动泵加入含三丙胺（,TPA,）的缓冲液，同时电极加电压，启动,ECL,反应过程,5,终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定,4,、免疫荧光,4.1,时间分辨免疫荧光（,TRFIA),美国,PerkinElmer,芬兰,Wallac,新波,达安基因,4.2,光激化学发光（,Lica,）,博阳,4.3,多种技术综合,美国雅培,AxSYM MEIA,日本东曹,MEIA,【,化学发光免疫分析种类,】,基本原理,TRFIA,是用,镧系稀土元素螯合物,标记抗体或抗原，检测标本中相应的抗原或抗体，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。,时间分辨荧光免疫分析,TRFIA,TRFIA,