第八章细胞凋亡

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,概述,细胞凋亡过程与机制,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡的检测,第八章 细胞凋亡,悉尼,布雷诺尔,罗伯特,霍维茨,约翰,苏尔斯顿,2002,年诺贝尔生理与医学奖获得者,概述,一、,细胞死亡的模式,Necrosis =,细胞病理性死亡,Apoptosis =,细胞自发性死亡,坏死,凋亡,apoptosis,Concept of apoptosis:,体内外生理或病理因素触发细胞内死亡程序细胞死亡,细胞坏死与细胞凋亡的区别,细胞凋亡与细胞坏死的区别,特征 细胞凋亡 细胞坏死,诱导因素 生理及弱刺激 强烈刺激,受累范围 单个细胞丢失 成群细胞死亡,膜完整性 保持到晚期 早期即丧失,细胞体积 减小、固缩 增大肿胀,染色质 凝聚成半月形 稀疏成网状,细胞器 无明显变化 肿张破坏,溶酶体 保持完整 破坏外溢,细胞形状,形成凋亡小体,破裂成碎片,基因组,DNA,有控降解 随机降解,大分子合成 一般需要 不需要,基因调控 有 无,后果 不引起炎症反应 引起炎症反应,意义 生理死亡方式 病理死亡方式,凋亡的生理学意义,:,胚胎发育期去除某些细胞,维持内环境稳定,增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞,参与防御反应,细胞毒,T,细胞,凋亡过多或不足疾病：,肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤,二 、凋亡时细胞的主要变化,1.,形态学改变,（,The morphologic characteristics of apoptosis,）,凋亡细胞（实体细胞）与周围细胞脱接触,胞膜空泡化（,Blebbing,）,细胞固缩（,Condensation,）、核固缩和发芽,凋亡小体（,Apoptotic small body,）,细 胞 凋 亡,(,扫描电镜,),正常细胞,(,扫描电镜,) (,透射电镜,),凋亡细胞,凋亡小体,DNA,片断化,caspase,激活,灭活凋亡抑制物,水解活性蛋白,水解结构蛋白,Ca 2+ /Mg 2+,Zn 2+,核酸内切酶激活,2.,生化改变,（,The biochemical characteristics of apoptosis,）,钙超载,DNA,片段化,（,DNA ladding pattern,）,核酸内切酶激活,核小体连接区,DNA,降解,180,200bp,整数倍的,DNA,片段,细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,凋亡的过程及机制,凋亡诱导因素,死亡信号,凋亡相关基因激活,Caspases,激活,、,DNase,激活,凋亡的执行,巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞,凋亡细胞清除,凋亡的机制,细胞凋亡的两条通路：死亡受体途径、线粒体途径,（,1,）,死亡受体途径,（,death receptor pathway,）,死亡受体,（,death receptor, DR,）,肿瘤坏死因子受体超家族成员，跨膜蛋白，与相应配体结合传递细胞信号,Fas(CD95), TNFR1, RAIL-R2/DR5,参与死亡受体信号转导的接头蛋白,：,死亡结构域蛋白,（,death domain protein, DD,）,TRADD,：,TNF,受体相关死亡结构域蛋白,TNF + TNFR1,（死亡结构域）,+,TRADD, ,细胞凋亡,FADD,：,Fas,相关死亡结构域蛋白,FasL + Fas,（死亡结构域）,+FADD, ,细胞凋亡,FasL + Fas,凋亡诱导复合物,（,DISC,）,FADD,（,C,端,DD,结构域与,Fas,胞内段结合,N,端,DED,结构域与无活性,caspase8,酶原交联）,caspase8,酶原聚集到复合物上,一系列,caspase,激活,细胞凋亡,FADD,（,Fas-associated death domain,）,DD,（,death domain,）,DED,（,death effector domain,）,FSAL,FADD,Pro-caspase-8,Caspase-8,Caspase-3,Pro-caspase-3,细胞凋亡,Fas,DED,DED,DD,（,2,）线粒体途径,线粒体释放细胞色素,C ,细胞凋亡,PT,孔开放,线粒体跨膜电位,，,细胞色素,C,释放,促凋亡蛋白,Bax,促,PT,孔开放,抗凋亡蛋白,Bcl-2,、,Bcl-xl,抑制,PT,孔开放,细胞色素,C + Apaf-1 + caspase9,前体,凋亡体,召集并激活,caspase3, ,细胞凋亡,Apaf-1,：凋亡蛋白酶活化因子,膜通透性、线粒体肿胀、,m,Apaf-1,活化,Cyt.c,线粒体途径,（,mitochondrial pathway,）,Ca,2+,NO,缺氧,活性氧,应激,PT,开放,Cyt.c,+,Pro-caspase-9,Caspase-9,ATP,Apaf-1,+,Apaf-1,活化,Cyt.c,CARD,Apoptosome,AIF,caspase-independent apoptosis,Pro-Caspase-3,凋亡,Caspase-3,Bid,Caspase-8,Caspase,依赖的细胞凋亡,（,Caspase-dependent apoptosis,）,Caspase,特点：,-,以酶原的形式存在,-,酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性,-,水解天冬氨酸,C,端肽键,故称,Caspases,(,C,ysteine,，,asp,artic acid,，,prote,ase,),Caspase,家族的分类,凋亡启动亚类,Caspase,蛋白酶,：,Caspase8,，,Caspase 9,，,Caspase10,凋亡效应亚类,Caspase,蛋白酶,：,Caspase3,，,Caspase6,，,Caspase7,ICE,(interlukin-1,converting enzyme),亚类,Caspase,蛋白酶,：,参与炎症反应,Caspase1,，,Caspase4,，,Caspase5,，,Caspase11, Caspase12,，,Caspase13,，,Caspase14,Caspase,通路分类,启动亚类（,Caspase -8 , -9, -10,）,效应亚类（,Caspase -3, -6, -7,）,Caspase,死亡受体途径,线粒体途径,大小亚基结合（二聚体）,caspase,激,活（四聚体）,Caspase,激活形式,Pro-caspase,：,NH,2,末端结构域 、,20KD,亚基、,10KD,亚基,剪切,Caspase,可激活,CAD,(caspase-activated DNase),核酸酶,，该酶在核小体的连接区将,DNA,切断，形成约,200bp,整倍数的核酸片段,正常情况下，,CAD,与抑制物,ICAD-DFF-45,结合，存在于胞质中，无活性,Caspase,活化后降解抑制物,ICAD,，,CAD,激活并入核降解,DNA,使其片段化,Pro-caspase-2,caspase-2,Pro-caspase-6,Caspase-6,Pro-caspase-7,caspase-7,Pro-caspase-9,ICAD,（抑制性,CAD,）,CAD,（,caspase,活化,DNA,酶）,CDA,进入细胞核内降解,DNA,细胞凋亡,剪切细胞内结构蛋白,caspase-9,Effector caspase,Caspase-3,Pro-caspase-3,Caspase,的作用,Caspase,非依赖的细胞凋亡,（,Caspase-independent apoptosis,）,凋亡诱导因子（,AIF,）,线粒体蛋白,AIF,释放到胞质内与抑制凋亡的因,子结合，从而促发凋亡,钙超载,钙超载引起凋亡机制,胞浆,Ca,2+, ,激活核转录因子，加速凋亡相关基因的转录,激活,Ca,2+,/Mg,2+,依赖的核酸内切酶，降解,DNA,链,激活谷氨酰胺转移酶，使细胞骨架分解,凋亡小体,细胞凋亡,细胞凋亡的调控,凋亡相关因素,凋亡信号的转导,凋亡相关基因,（,The mainly induced factors of apoptosis,）,Table,：,Influence factors of apoptosis,诱导性因素（,Inducers,） 抑制性因素（,Inhibitors,）,理化因素 射线、高温、强酸、 细胞因子,IL-2,、,NGF,等,强碱、应激、抗癌药 激素,ACTH,、睾丸酮、雌激素,激素和因子 糖皮质激素、,TNF,其它,Zn,2+,、苯巴比妥、半胱氨,免疫性因素,CTL,分泌的粒酶 酸蛋白酶抑制剂、,EBV,、,病原体因素,HIV,、,HCV,牛痘、,病毒、中性氨基酸,1,、影响细胞凋亡的因素,2,、凋亡信号转导的特点,多样性：,不同种类细胞有不同的信号转导系统,偶联性：,死亡信号转导系统与细胞增殖、分化过程,中的信号转导系统在一些环节上交叉、偶联,同一性：,不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系,统引起细胞凋亡,多途性：,同一凋亡诱导因素可经过多条信号途径触,发细胞凋亡,3,、细胞凋亡的调控基因,（,Regulated mechanism of apoptosis,）,表,1,细胞凋亡的调控基因,功能 基因,抑制凋亡基因,Bcl-2 Bcl-X,L,、,A1/Bfl-1,、,Bcl-w,、,Bcl-G,和,Mcl-1,等,促凋亡基因,P53,、,Bax,、,Bad,、,Bak,、,Bid,、,Bim,、,Bik,、,Bok,、,Bcl-B,、,Bcl-Xs,、,Krk,、,Mtd,、,Nip3,、,Nix,、,Noxa,等,双向调控基因,c-myc,、,Belx,Bcl-2,基因,（,B cell lymphoma/leukemia-2,）,广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞,Bcl-2,家族已发现,15,个成员，可分为,3,个亚族：,Bcl-2,亚家族,：抑制细胞凋亡,Bax,亚家族：,促进细胞凋亡,BH3,亚家族：,促进细胞凋亡,Bcl-2,抑制凋亡机制：,抑制线粒体,PT,孔开放，,Cyt.c,、,AIF,释放,结合和灭活,Apaf,-1,，阻断,caspase-9,活化,特异性结合细胞色素,C,维持细胞钙稳态,c-myc, bcl-x,促进增殖,c-myc(,转录调节因子,),诱导凋亡,Bcl-XL ,抑制凋亡,Bcl-x,Bcl-Xs ,促进凋亡,GF,p,53,促凋亡机制：,-,与,Bcl-2,基因相互作用，下调,Bcl-2,的表达,-,诱导线粒体内凋亡的相关蛋白（,Bax,等）表达，并触发细胞色素,C,释放和,caspase,活化,-,诱导死亡受体,Fas,表达,C-myc,双向调控凋亡,调控细胞周期基因，编码的蛋白是,DNA,结合蛋白，调控基因转录。,GF,充足时主要激活介导细胞增殖的基因,GF,不足时激活凋亡基因,凋亡与疾病,（,Diseases associated to apoptosis,）,表： 与细胞凋亡异常相关的疾病,凋亡不足 凋亡过度,肿瘤 肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌 发育异常 气管,-,食管瘘、房（室）间隙缺,、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前 损、唇（腭）裂、短肢畸形、,列腺癌等 尿道下裂以及多囊肾等,发育异常 先天性消化道、胆道、肛门狭,CNS Alzheimer,病、,Parkinson,病、,窄或闭锁、动脉导管未闭、两 肌萎缩性侧索硬化症、色素性,性畸形、甲状舌骨囊肿等 视网膜病，脊肌肉萎缩、早老,免疫系统 系统性红斑狼疮、糖尿病、类 性痴呆,风湿性关节炎、桥本甲状腺炎 免疫系统 免疫缺陷病、,AIDS,、多发性的硬化症等,（一）细胞凋亡不足（,Apoptosis inhibition,）,1.,肿瘤（,Tumor,）,bcl-2,基因过表达,85%,滤泡状,和,20%,弥漫性,B,细胞淋巴瘤,染色体,t,（,14;18,）易位,IgH,基因与,bcl-2,基因拼接,bcl-2,基因活化,细胞凋亡速率,肿瘤发生,（乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在,Bcl-2,高表达）,p,53,基因缺失或突变,p53,的稳定性、细胞内定位或（和）活性异常,p,53,表达或功能缺陷 细胞凋亡率 肿瘤发生,病毒的癌基因,HBV,编码的,HB,X,是,Caspase-3,的强效抑制物，与肝癌发生密切相关,异常融合蛋白,慢性髓细胞性白血病（,CML,）,染色体易位,t (9,；,22),Bcr-abl,融合基因（,p210,Bcr-abl,蛋白质）,NF-,B,活化、,细胞凋亡速率,髓系祖细胞的克隆扩增,肿瘤发生,2,自身免疫病（,Autoimmune diseases,）,针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除，机体产生针对自身抗原的体液免疫和细胞免疫，导致器官组织损伤。,（二）细胞凋亡过度（,Apoptosis excess,）,1.,心肌缺血与缺血,-,再灌注损伤,特点,缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞坏死为主。,在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主；,轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主；,机制,氧化应激,Fas,通路,p53,基因转录增加,细胞凋亡在疾病防治中的意义, 合理利用凋亡相关因素,1.,诱导靶细胞凋亡,放疗、化疗,高热、高温,2.,减少细胞凋亡 ：,NGF,、促生长因子、抗氧化剂,抑制,Bcl-2,抗凋亡作用,促进促凋亡基因作用,增强,P53,促凋亡作用,干预凋亡信号转导, 调节凋亡相关基因, 控制凋亡相关酶学机制, 防止线粒体跨膜电位的下降,细胞凋亡的检测,1,、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测,2,、磷脂酰丝氨酸外翻分析（,Annexin V,法）,3,、线粒体膜势能（,mt,）的检测,4,、,DNA,片断化检测,5,、,TUNEL,法,6,、,Caspase-3,活性的检测,7,、凋亡相关蛋白,TFAR19,的表达和细胞定位分析,1,、,细胞凋亡的形态学检测,光学显微镜和倒置显微镜,未染色细胞：凋亡细胞,V,变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体。,染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。,荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜,一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的,DNA,特异性染料有：,HO ,Hoechst 33342;,HO,Hoechst 33258;,DAPI,。,电子显微镜观察,Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process,（,488nm,400,）,电镜观察,凋亡细胞体积变小，胞质浓缩。凋亡,期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多空泡结构。,IIa,染色质高度凝集、边缘化。凋亡晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,流式细胞术检测：,2,、,磷脂酰丝氨酸外翻分析（,Annexin V,法）,Phosphatidylserine(PS),正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期从细胞膜的内侧翻转到膜表面,Annexin-V,：,Ca,2+,依赖性磷脂结合蛋白，能与,PS,高亲和力特异性结合。将,Annexin-V,进行荧光素（,FITC,、,R-PE,）标记后作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。,2,、磷脂酰丝氨酸外翻分析（,Annexin V,法）,Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV + PI,3,、,线粒体膜势能（,mt,）的检测,线粒体荧光染料,：,Rhodamine 123,、,DiOC,6,（,3,）、,JC-1,、,TMRM,等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,4,、,DNA,片段化分析,细胞凋亡时染色质,DNA,在核小体单位之间的连接处断裂,形成,180,200bp,整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱,(DNA ladder,),。,5,、,TUNEL,法,6,、,Caspase,活性检测,7,、凋亡相关蛋白,TFAR19,蛋白的表达,和细胞定位分析,凋亡早期,TFAR19,表达,并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。,利用荧光素（,FITC,）标记的,TFAR19,单克隆抗体为探针进行,TFAR19,蛋白的细胞定位分析,Double staining analysis,of nuclear localization of,TFAR19 in K562 and,HeLa cells treated with,VP16,