兽医疫病监测诊断技术(终稿)

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,兽医疫病监测诊断技术,提纲,疫病面临的复杂形势,常用实验室检测技术,动物疫病诊断技术现状,及应用,检测技术发展方向与未来展望,1,疫病面临的复杂形势,禽病种类多,农业部,一、二、三类动物疫病病种名录,中列入,157,种；其中一类禽病,2,种（高致病性禽流感、新城疫）；二类禽病,18,种（鸡传染性喉气管炎、鸡传染性支气管炎、传染性法氏囊病、马立克氏病、产蛋下降综合征、禽白血病、禽痘、鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭浆膜炎、小鹅瘟、禽霍乱、鸡白痢、禽伤寒、鸡败血支原体感染、鸡球虫病、低致病性禽流感、禽网状内皮组织增殖症,）,；三类禽病,4,种（鸡病毒性关节炎、禽传染性脑脊髓炎、传染性鼻炎、禽结核病,）,。,4,病毒病原毒株多、变异快,口蹄疫：,7,个型，多个亚型；,我国,O,型、亚洲,I,型、,A,型,禽流感：,A,、,B,、,C3,个型；其中,B,、,C,两型仅能对人致 病，,A,型可对人、猪、马和禽致病。,A,型：,H1H16,亚型；,H5,亚型,：变异株不断出现,新城疫：,病毒分为低毒力型（即缓发型）、中等毒力型（即中发型）、强毒力型（即速发型）,3,型,PRRS,：,1996,年美洲型；,2006,年变异株；,2009,年欧洲型,1,株。,2012,年列入国家监测计划的动物疫病（,16,种）,高致病性禽流感,、,口蹄疫、高致病性蓝耳病、猪瘟,鸡新城疫,、,布鲁菌病、牛结核病、血吸虫病、狂犬病,牛海绵状脑病、痒病、牛传染性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽疫、非洲猪瘟、蓝舌病,国家强制免疫,动物疫病,外来动物疫病,6,主要疫病的国家指定监测方法,病 名,指定诊断方法,高致病性禽流感,血凝抑制试验（,HI,）,鸡新城疫,血凝抑制试验（,HI,）,传染性法氏囊病,血凝抑制试验（,HI,）、,ELISA,传染性支气管炎,血凝抑制试验（,HI,）,口蹄疫,正向间接血凝试验、液相阻断,ELISA,VP1-ELISA,猪瘟,正向间接血凝试验、阻断,ELISA,高致病性猪蓝耳病,ELISA,疫苗种类各异、诊断试剂和方法多样,以禽流感为例,血清学诊断技术,分子诊断技术,血凝与血凝抑制试验,神经氨酸酶抑制试验,酶联免疫吸附试验,免疫荧光技术,中和试验,琼脂扩散试验,RT-PCR,和,Realtime RT-PCR,荧光,RT-PCR,、,RT-PCR-ELISA,依赖核酸序列的扩增技术,(NASBA),环介导的等温扩增技术,(LAMP),基因芯片技术,8,2,常用实验室检测技术,常用实验室检测技术,组织病理学检测技术,血清学检测技术,分子生物学检测技术,病原学检测技术,诊断新技术,组织病理学检测技术,1,.,病理学检测技术,是利用疫病引起的动物组织发生特征性的病变和病理变化对动物疫病进行诊断。,2.,免疫病理学检测技术,(,免疫组织化学技术,),免疫组织化学方法不仅可在脏器组织中特异地检出病原,又可发挥病理学检测所具有直观、抗原定位准确的特点,还可在脏器组织原位检测出病原（原位,PCR,）的同时，观察到组织病变与该病原的关系，从而有助于了解疫病的发病机理和病理过程,。,血清学检测技术,按其反应性质的不同可分为：,凝集性反应,(,如凝集试验和沉淀试验,),标记抗体技术,(,包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体等,特点： 敏感、快速（,ELISA,只需要,12,小时）。,补体参与的反应,(,补体结合试验、免疫粘附血凝试验等,),。,中和试验,(,病毒中和试验和毒素中和试验,),特点： 时间长，约需要,18,小时才能获得结果。,正向间接血凝诊断技术,特点：,正向间接血凝为一种微量的定量反应试验，其应用广泛，其无需昂贵的设备，操作简单，并且有快速、敏感、特异性。,操作要点及注意事项：,A.,试验准备：,制备,1%,红细胞悬液；选用孔底应光洁透明无可见 附着物的反应板,(,一次性的最好,),；待检血清要新鲜，未腐败、溶血，无悬浮物。,B.,操作过程：,尽可能的保证样品被全部加入反应孔；每次滴加抗原前应充分摇匀，从稀释度高的孔开始加起，并避免滴头和孔内的液体直接接触；避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。,C.,结果判定：,正确判断,50%,凝集反应,待检样品,2,待检样品,1,阳性对照,阴性对照,凝集和凝集抑制反应原理示意图,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、重复性好、安全、适合大批量标准化检测的特点。,是当前应用最广、发展最快的一项新技术，目前该方法已被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。,其基本过程是将抗原,(,或抗体,),吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用酶标仪判定结果。,间接法（,Indirect ELISA,）：,将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗,检测液相中未知抗体,双抗夹心法（,Sandwich ELISA),：,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,检测液相中的可溶性抗原,竞争法（,Competitive ELISA),：,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,检测液相中的可溶性抗原或抗体,ELISA,类型,酶联免疫吸附试验,(,E,NZYME-,L,INKED,I,MMUNO,S,ORBENT,A,SSAY,ELISA),3.,原理,（以间接性,ELISA,为例）,：,显色,间接,ELISA,检测抗体,双抗原（体）夹心法测抗体（原）,包被抗原,*,酶标抗原,待测抗体,包被抗体,*,酶标抗体,待测抗原,双抗体夹心法,双抗原夹心法,双抗体夹心法检测抗原流程图,竞争,ELISA,检测抗体示意图,分子生物学检测技术,用于动物疫病特异性病原基因、病原基因变异与进化分析，及时准确掌握动物疫病分子流行病学动态，为疫病防治提供基因理论分析依据。,核酸探针技术、基因序列分析,比如基因芯片试剂盒等。,聚合酶链反应（,PCR,）（应用最广）,1,、疫病的早期诊断和不完整病原的检测,2,、快速、准确、安全的检测病原体,3,、在病原体分类和鉴别中的应用,PCR,仪,基因芯片仪,聚合酶链式反应（,PCR),是以,DNA,高温变性、低温退火（复性）及适温延伸,为原理设计的。通过,PCR,技术获取病原微生物的特异,DNA,片段，从而为疾病诊断提供重要依据。,特点：,特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。,23,反转录,PCR,技术,即,RT-PCR,技术。用于检测,RNA,病毒。,首先提取总,RNA,，然后加入引物在反转录酶的作用下合成,cDNA,，加热变性成为单链,cDNA,后，加入与之互补的另一对引物，进行,PCR,反应。,分为一步法和两步法两种,RT,RT-PCR,反应原理图,多重,PCR,技术,(MULTI-PCR,）,它是一种特殊的PCR形式，其最突出的特点是一次PCR反应在同一反应体系中同时加入多对不同PCR引物和相应的模板，可同时检测、鉴别出多种病原体，,在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值,。,病原学检测技术,1.,细菌的分离与鉴定,2.,病毒的分离与鉴定,是病毒性疫病检测、诊断、流行病学调查和未知新病毒进行分类鉴定的重要方法之一。但是对实验室能力要求较高，且耗时长。,3.,寄生虫检测,寄生虫病诊断中其定性的实质性方法有以下几种,:,虫卵检查法、虫体检查法、免疫学检查法和分子生物学检查法。,诊断新技术,我国免疫预防为主的动物防疫政策，决定了在现实的动物疫病监测工作中，迫切需要实用的对动物疫病病原的,快速诊断技术,以及能,区分免疫动物和自然感染动物的鉴别诊断技术,。,目前国内符合上述要求的诊断新技术主要有以下,4,种,:,1.,免疫胶体金快速诊断试纸条,2.,荧光,PCR,3.,鉴别诊断技术,4.,原位,PCR,技术,免疫胶体金快速诊断试纸条,胶体金技术（,Immunogold,labeling technique）,是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。,简捷快速：操作简单，一般只要5,-10min,就会出结果，而其它方法如,ELISA,需要1,-2h,，,PCR,需要时间更长。,结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。,特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。,胶体金,（,Colloidal gold）,是氯金酸（,HAuCl,4,）,的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。,29,胶体金试纸条示意图,检测线,质检线,吸收垫,样品垫,硝酸纤维素膜,连接垫,（胶体金垫）,背衬,（底板）,30,实时荧光定量,PCR,与普通,PCR,相比：,1.,自动化程度高，极短的检测时间（没有了制胶和,PCR,产物电泳步骤，快速热循环仪也缩减了运行时间，在,30,分钟内可以得到完美的实验结果 ）；,2.,敏感性为普通,PCR,的,100,倍；,3.,直观的软件分析；,4.,有效解决,PCR,污染问题；,5.,安全性更好。,6.,不足：资金投入大，,检测成本高。,实时荧光定量,PCR,反应软件分析截图,实时荧光定量,PCR,仪,31,如何定量？,Ct,值的概念,Ct,值的定义是,PCR,扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。,32,定量原理,确定初始模板的浓度,初始,DNA,量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少,Log,浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,33,鉴别诊断技术,鉴别诊断技术的重要性：,A,：区分自然感染抗体和疫苗免疫抗体的鉴别诊断技术；,B,：从普遍免疫的动物群体中甄别出自然感染和带毒的动物。,该项技术的核心是基因工程技术、,单克隆抗体技术,与诊断技术的综合运用，其科技水平高，难度较大。,单克隆抗体技术,目前市场上已有部分利用单克隆抗体制备的,ELISA,试剂盒 （比如猪瘟）。,原位,PCR,分子病理学新技术,是一种将,PCR,技术与原位杂交技术结合起来的可以检测组织细胞中微量,DNA,或,RNA,且可精确定位的新技术。,特点：敏感度更高，优于免疫组化技术。,目前应用情况：主要用于病毒检测，也有检测组织中寄生虫感染的报道。,3,检测技术发展方向与未来展望,血清学检测技术发展方向,简单、快速便于普及的快速诊断技术,以胶体金标记技术为代表，操作简单、快捷，实现现地现用。,高度集成、自动化的仪器诊断技术,以,ELISA,（全自动酶免工作站）为代表，可实现大规模操作，且灵敏度高、特异性强。,分子检测技术的发展方向,1,、自动化,利用全自动仪器完成核酸提取、反应液配制、上机反应和结果分析的所有步骤,多功能新型生物液体处理工作站：可以一机实现,DNA/ RNA,提取和,PCR,反应建立,实时荧光定量,PCR,仪：可以一机实现上机反应和结果分析,2,、高通量,在提高灵敏度和特异性的基础上，实现一次检测分析所有常见疫病和对一种疫病分型的目的。,3,、检测与核酸序列分析的综合,随着测序仪器设备的完善，将检测与序列分析结合的诊断技术将逐步应用于临床。,分子检测技术的发展方向,结束语,正确的制定动物疫病监测方案，合理的综合选择实用的诊断技术，可以帮助养殖企业制定科学的动物疫病防治策略和计划，建立有效的净化措施，提高生产质量和经济效益，以保障畜牧业快速、健康、持续发展，保障公共卫生事业，保护人民身体健康。,谢 谢 ！,41,