专题五课题1-dna的粗提取与鉴定.

单击此处编辑母版标题样式,*,专题,5 DNA,和蛋白质技术,课题,1 DNA,的粗提取与鉴定,一、基础知识,（一）提取,DNA,的方法,1,、提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,3,、提取,DNA,的基本思路,利用,DNA,与,RNA,、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取,DNA,，去除其他成分,4,、,DNA,的溶解性,DNA,和蛋白质等其他成分在不同浓度的,NaCl,溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使,DNA,充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,5,、讨论：,根据,DNA,在,NaCl,溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，,DNA,的溶解度最小？,DNA,在,NaCl,溶液中的溶解度是如何变化的？,在,NaCl,溶液浓度低于,0.14 mol/L,时，,DNA,的溶解度随,NaCl,溶液浓度的增加而逐渐降低；在,0.14 mol/L,时，,DNA,溶解度最小；当,NaCl,溶液浓度继续增加时，,DNA,的溶解度又逐渐增大。,当氯化钠的物质的量浓度为,2 mol,L,时，,DNA,的溶解度最大，浓度为,0,14 mol,L,时，,DNA,的溶解度最低。利用这一原理，可以使,DNA,在盐溶液中溶解或析出,如何通过控制,NaCl,溶液的浓度使,DNA,在盐溶液中溶解或析出？,DNA,不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将,DNA,与蛋白质进一步分离,6,、,DNA,在酒精溶液中的溶解性,7,、,DNA,对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对,DNA,没有影响,大多数蛋白质不能忍受,60,80C,的高温，而,DNA,在,80C,以上才会变性,洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对,DNA,没有影响,8,、,DNA,的鉴定, DNA,与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定,DNA,的试剂,甲基绿 （蓝绿色）,二、,DNA,的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,1,、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取,2,3,种实验材料）,2,、原则：凡是含有,DNA,的生物材料都可以考虑，但选用,DNA,含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含,DNA,的滤液,1,、动物细胞,答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂,(,细胞膜和核膜的破裂,),，从而释放出,DNA,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜,2,、植物细胞,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于,DNA,的释放；食盐的主要成分是,NaCl,，有利于,DNA,的溶解,实例：提取洋葱,DNA,时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,答：研磨不充分会使细胞核内的,DNA,释放不完全，提取的,DNA,量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,（三）去除滤液中的杂质,为了纯化提取的,DNA,需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和,RNA,等杂质和,DNA,。,讨论：为什么反复地溶解与析出,DNA,，能够去除杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解,DNA,，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使,DNA,析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出,DNA,，就能够除去与,DNA,溶解度不同的多种杂质,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的,DNA,与蛋白质分开；方案三利用的是,DNA,和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与,DNA,分离,方案二利用了酶的专一性；方案三利用了,DNA,的稳定性。,（四）,DNA,的析出与鉴定,DNA,的析出用的是与滤液体积相等的,冷却的酒精溶液（体积分数为,95,）,，静置,2,3min,，溶液中会出现,白色丝状物，,这就是粗提取,DNA,。用玻璃棒沿,一个方向,搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分,1,、,DNA,的析出,2,、,DNA,的鉴定,鉴定,DNA,时在试管中先加入物质的量的浓度为,2mol/L,的,NaCl,溶液,5ml,于两只试管中，其中一只加入,DNA,丝状物，各加入,二苯胺,4ml,试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热,5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有,DNA,的溶液是否有,蓝色,（一）案例一：以鸡血为实验材料进行,DNA,的粗提取,三、实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1,、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的,DNA,含量丰富，材料易得,2,、实验原理, DNA,在,NaCl,溶液中的溶解度，是随着,NaCl,的浓度的变化而改变的。当,NaCl,的物质的量浓度为,0.14 mol,L,时,DNA,的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在,NaCl,溶液中的,DNA,析出。, DNA,不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的,DNA,。, DNA,遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定,DNA,的试剂。,3,、实验材料和用具：,鸡血细胞液（,510ml,）；体积分数为,95%,的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却,24h,）；蒸馏水；质量浓度为,0,g/ml,的柠檬酸纳溶液；务质量的浓度分别为,2mol/L,和,0,015mol/L,的氯化纳溶液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（,100ml,，一个）；烧杯；（,100ml,，一个，,50ml,、,500ml,各二个）；试管（,20ml,，二个）；漏斗；试管夹；纱布。,4,、课前准备鸡血细胞液,过程,课前准备鸡血细胞液的过程,4,、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为,0,1g/ml,的,柠檬酸钠溶液（抗凝剂）,100ml,，置于,500ml,烧杯中。注入新鲜的鸡血（约,180ml,），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用,1000r/min,（转每分）的离心机离心,2min,，血细胞沉淀于离心管底部。实验时，,用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）,过程,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的,Ca,2+,发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的,Ca,2+,大大减少，血液就不会凝固,鸡血细胞破碎以后释放出的,DNA,，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少,DNA,的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项,讨论：提取鸡血中的,DNA,时，为什么,除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,5,、方法步骤,提取鸡血细胞的细胞核物质,将制备好的鸡血细胞液,5 mL,10mL,，注入到,50 mL,烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水,20 mL,，同时用,玻璃棒,充分搅拌,5 min,，,使血细胞加速破裂。,然后，用放有,纱布的漏斗,将血细胞液过滤至,500mL,。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,5,、方法步骤,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（,1,）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（,2,）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎,DNA,（,3,）滤去的是什么物质？,得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的,DNA,溶解,DNA,析出含,DNA,的粘稠物,滤取含,DNA,的粘稠物,溶解,DNA,将氯化钠的物质的量浓度为,2 mol/L,的溶,40mL,加入到滤液中，并用,玻璃棒沿一个方向搅拌,1min,，使其混合均匀，这时,DNA,在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用,玻璃棒不停地轻轻搅拌，,这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于,0.14 mol,L,）,析出含,DNA,的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低,NaCl,溶液浓度到使,DNA,溶解度最低点，使,DNA,从,NaCl,溶液中析出,将溶液中的,DNA,与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。,实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于,DNA,分子的附着和缠绕,注意事项：,滤取含,DNA,的粘稠物,用放有,多层纱布,的漏斗，过滤步骤,3,中的溶液至,500mL,的烧杯中，含,DNA,的,粘稠物被留在纱布上,将,DNA,的粘稠物再溶解,过滤含有,DNA,的氯化钠溶液,提取含杂质较少的,DNA,将,DNA,的粘稠物再溶解,取,1,个,50 mL,烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为,2 mol,L,的溶液,20mL,。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，,用玻璃棒不停地搅拌，,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,过滤含有,DNA,的氯化钠溶液,取,1,个,100 mL,烧杯，用放有,两层纱布,的漏斗过滤步骤,5,中的溶液。取其滤液，,DNA,溶于滤液中,提取含杂质较少的,DNA,在上述滤过的溶液中，加入,冷却的、酒精的体积分数为,95,的溶液,50mL,（使用冷却的酒精，对,DNA,的凝集效果较佳），并用,玻璃棒搅拌，,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是,DNA,答：因为,DNA,不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的,DNA,丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（,2,）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（,1,）为什么要加,50mL,的冷酒精？,取两支,20 mL,的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为,0,015 mol,L,（或者,2mol/L,）的溶液,5 mL,，将丝状物放入其中一支试管中，,用玻璃棒搅拌，,使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入,4mlL,的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热,5 min,，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化,DNA,的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（,2,）这一鉴定结果说明什么问题？,（,1,）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是,DNA,（,3,）,DNA,的直径约为,2010-10 m,，实验中出现的丝状物的粗细是否表示,1,个,DNA,分子直径的大小？,答：,DNA,分子直径只有,2 nm,。丝状物是多个,DNA,子聚在一起形成的,提取鸡血细胞的细胞核物质,(,过滤,),溶解,DNA,析出含,DNA,的粘稠物,滤取含,DNA,的粘稠物,将,DNA,的粘稠物再溶解,过滤含有,DNA,的氯化钠溶液,提取含杂质较少的,DNA,DNA,的鉴定,答：整个实验共,“,两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌,”,6,、讨论：,两次蒸馏水,第一次：,细胞吸水胀破,第一步,第二次：使,DNA,黏稠物析出 第三步,（,1,）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为,2,层,三次过滤,第一次：,DNA,存在于滤液里 第一步,第二次：,DNA,被留在纱布上 第四步第三次：,DNA,存在于滤液里 第六步,两次析出,第一次：用,0.14 mol,L,的,NaCI,溶液含杂质多,第三步,第二次：用冷却的,95,的酒精,第七步,六次搅拌：第一、二、三、五、七、八步,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的,DNA,（准备阶段还有,1,次）,（,2,）为什么反复地溶解与析出,DNA,，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解,DNA,，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使,DNA,析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出,DNA,，就能够除去与,DNA,溶解度不同的多种杂质,（二）,案例二：以菜花为实验材料进行,DNA,的粗提取,1,、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为,95,的乙醇溶液放入冰箱冷冻室,24 h,2,、提取,DNA,的具体步骤,取材：称取,30 g,菜花，去梗取花，切碎,研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入,10 mL,研磨液，充分研磨,10 min,研磨液的配制方法如下：将,10.1 g Tris,加入到,50 mL,蒸馏水中，使其溶解，然后，用,2 moL/L,的,HCl,溶液调节,pH,至,8.0,，再加入,8.76 g NaCl,、,37.2 g EDTA,、,20 g SDS,。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至,1 000 mL,Tris/HCl:,提供缓冲体系，,DNA,在这一体系中呈稳定态（,Tris,为三羟甲基氨基甲烷）,EDTA,（乙二胺四乙酸二钠）：是,DNA,酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后,DNA,酶降解,DNA,SDS,（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与,DNA,分离,过滤：,在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中,(,有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用,1000 r/min,的转速，离心,2,5 min,，取上清液放入烧杯中,),。在,4 ,冰箱中放置几分钟后，再取上清液,沉淀：,将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为,95,的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液,(,玻璃棒不要直插到烧杯底部,),。沉淀,3,5 min,后，可见白色的,DNA,絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上,然后进行,以鸡血为实验材料进行,DNA,的粗提取,观察你提取的,DNA,颜色，如果不是白色丝状物，说明,DNA,中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的,DNA,含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,四、课题成果评价,（一）是否提取出了,DNA,本实验提取的,DNA,粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,（二）分析,DNA,中的杂质,（三）不同实验方法的比较,对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如,DNA,的纯度、,DNA,的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好,1,、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（ ）,A .,防止凝血,B.,加快,DNA,析出,C .,加快,DNA,溶解,D.,加速凝血,练一练,A,2,、,DNA,的溶解度最低时，,NaCl,的物质的量浓度为（ ）,A 2mol/l B 0.1mol/l,C 0.14mol/l D 0.015mol/l,3,、在向溶解,DNA,的,NaCl,溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ ）,A,加快,DNA,溶解的速度,B,加快溶解杂质的速度,C,减小,DNA,的溶解度，加快,DNA,析出,D,减小杂质的溶解度，加快杂质的析出,C,C,4,、向溶有,DNA,的,2mol/L,的,NaCl,溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中,DNA,的溶解度变化情况分别是,A,减小,;,减小,B,增大,;,增大,C,先减小后增大,D,增大,;,减小,5,、欲使溶有,DNA,的,2mol/L,的,NaCl,溶液中的,DNA,析出，最有效的办法是,A,加蒸馏水,B,加矿泉水,C,加清水,D,加生理盐水,c,A,6,、与析出,DNA,粘稠物有关的叙述，不正确的是,A,操作时缓慢滴加蒸馏水，降低,DNA,的溶解度,B,操作时用玻棒轻缓搅拌以保证,DNA,分子的完整,C,加蒸馏水可以同时降低,DNA,和蛋白质的溶解度,D,当丝状粘稠物不再增加时，,NaCl,溶液的浓度可以认为是,0.14mol/L,c,7,、,DNA,遇二苯胺会染成（沸水浴）,A,硅红色,B,红色,C,紫色,D,蓝色,D,8,此实验中使用几次,NaCl,溶液？,一共,4,次。,第,2,，第,5,，第八,8,。,都是溶解,DNA,，,第,3,步析出,DNA,。,