2.-实时荧光定量PCR技术应用(终版)

,First level: Arial 20pt,Second level: Arial 18pt,Third level: Arial 16pt,Title : Arial 24pt,61,Proprietary & Confidential,实时荧光定量,PCR,技术应用,荧光定量,PCR,整体解决方案,临床检测与诊断,基因分型,拷贝数变异研究,稀有突变检测,分子诊断,基因治疗药物,再生药物,科学研究,相对定量,绝对定量,基因表达,溶解曲线分析,microRNA,蛋白表达研究,质量与安全检测,公共卫生,食品安全检测,动物健康,法医应用,亲子鉴定,身份识别,“,Solutions Provider”,提供解决方案,Real-Time PCR,技术在,QST,领域的应用,提供四个方面的应用和解决方案,食品安全,食源病菌快速检测,GMO,定量,原料来源,分析，如动物源性成分检测,动物健康,动物和水生动物疾病快速检测,公共卫生,传染病,快速筛查,药品,分析,残留,DNA,定量,支原体检测,病毒快速,检测,食品安全,病原微生物检测（细菌、病毒）,“食源性致病微生物”引起食品污染是食源性疾病发生的主要原因，仅由“食源性致病微生物”引发的疾病有就,250,种之多，在全世界造成了很多的食品安全事件。,国家卫生计生委截止,2013,年通过突发公共卫生事件网络直报系统，共收到全国食物中毒类突发公共卫生事件报告,152,起，中毒,5559,人，死亡,109,人。,微生物引起的食源性疾病，已成为我国食品安全的头号杀手，一旦发生，对公众的健康危害是明确而广泛的。,食品法典委员会,(CAC),已将微生物性健康危害列为食源性危害的三大原因之一。,病原微生物,细菌检测,的,重要性,1.,Isolate DNA,2.,Combine sample with,MicroSEQ Assays,3.,Perform amplification on thermal cycler,4. Analyze results using,R,eal-Time PCR,Sofftware,Add 100 L PrepMan,Ultra reagent into tube,Suspend loopful of cells from plate or culture,Boil 100 C 10 min,Vortex 20 sec,，,Centrifuge 2 min. Transfer supernatant to new tube,MicroSEQ Assays,30ul DNA sample,QS 12K, ViiA7,QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlus,R,eal-Time PCR,Software,MicroSEQ,Assays,Workflow,25,g,固体样品,+225 mL,BPW,（若需要增菌）,OR,225 mL,生理盐水（若无需增菌）,25,g,液体样品,+225 mL,BPW,（若需要增菌）,OR,直接取样进行检测（若无需增菌）,均质：,8000 r/min,10000 r/min,均质,1 min,2 min,。,或放入盛有,BPW,肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打,1 min,2 min,，制备成,1:10,的样品匀液,增菌（可选择）,：,36 1 ,培养,8 h,18 h,不需要增菌的样品，直接取,1:10,样品匀液上清液或样品原液备用,抽提核酸：,机器自动化提取或者手工提取,Real time PCR,检测：,配置反应体系、设置程序、仪器运行、软件分析,打印检测结果,具体检测流程,以沙门式菌为,例,MicroSEQ,检测系列,TaqMan,检测,系列,沙门氏菌,单增李斯特菌,大肠杆菌,O157,大肠杆菌,O104,李斯特菌属,霍乱,/,副弧,/,创伤弧菌三重检测,沙门氏菌,(,肠道、肠炎）,大肠杆菌,O157:H5,阪崎肠杆菌,单增李斯特,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌菌属,空肠弯曲杆菌,产酸克雷伯菌,伤寒沙门菌,VTX01/VTX-2,白色念珠菌,冻干试剂的优点,缩短手动操作时间,由于较少的移液步骤，在不同时间、操作者和实验室之间提高结果可重复性和一致性,降低污染风险,减少试剂浪费,在任何,Applied Biosystems,实时荧光定量,PCR,平台上运行,标准或快速模式,试剂稳定,储存于,28C,，不会因冻融而导致试剂损伤,保存期限为生产日期后,18,个月,检测限度与液体试剂相当或更好,目的,：,利用特异性,TaqMan,荧光定量,PCR,技术,建立大肠杆菌,O157,H7,快速敏感特异,的检测方法,。,方法：,以,大肠杆菌,O157,H7,的,rfbE,基因作为靶序列,设计一对引物和探针,优化,引物和探针的浓度比和,Mg2 +,浓度,以大肠杆菌,O157,H7,和,10,种相关细菌考核检测体系,的灵敏性,、稳定性和特异性,。,结论：,该,方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。,大肠杆菌,O157,H7,实时荧光,PCR,快速检测方法的建立,结果：,引物,和探针的浓度为,0.6moL/L,、,0.8moL/L, Mg2 +,浓度为,4mmoL/L,时,具有良好的特异性和敏感性,。,在,10,株相关菌株的检测中,除大肠杆菌,O157,H7,出现很好的阳性外,其余,菌株均,为阴性,。,定量,检测低限为,17cfu/mL,。,同,一样品重复检测,3,次,Ct,值的变异系数均小于,5%,。,图,1,大肠杆菌,O157,H7 TaqManPCR,检测灵敏性的扩增结果,表,1,大肠杆菌,O157H7,TaqManPC,检测,体系引物和探针序列,仪器平台：,ABI 7300,食源性病毒因其蛋白质外壳的保护作用，能够在食品加工、储藏及人体消化过程中生存下来，并通过病人的分辨，经口传播和扩散，造成食源性疾病大规模的暴发流行。,由食源性病毒所致的人、畜疾病是一个全球性的公共卫生问题。,1988,年上海爆发甲肝疫情，,30,万人死亡。因此甲型肝炎、病毒性肠炎及其他病毒性疾病对人类造成的健康损害,仍是当今社会一种重要的生物性危害因素。,另外，随着人口年龄逐步老龄化，经济活动和食品贸易交往日益全球化，病毒性食源性疾病的发生也将不断增加。,食源性病毒包括：,呕吐类：诺如病毒 ； 肝炎类：肝炎病毒,水样腹泻类：诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒,其他病毒,病原微生物,病毒检测,的,重要性,1.,Isolate RNA,2. Combine sample with CeeramTools Assay,3.,Perform amplification on thermal cycler,4. Analyze results using,Real-Time PCR Sofftware,I,solate,RNA using Nucleic Acid Extraction Kit from samples,Prepare the reaction,mix,NoVGI/IPC Master Mix,RT-PCR enzyme mix,RNA sample,QS 12K, ViiA7,QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlus,R,eal-Time PCR,Sofftware,CeeramTools RT-PCR,一步法试剂盒,Workflow,ceeramTools ,一体化、即用型,RT-PCR,一步法试剂,盒,诺如病毒,(GI,和,GII,型,),检测试剂盒,诺如病毒,(GI,和,GII,型,),定量标准品,快速、准确、可靠的食源性病毒检测方案,诺如病毒检测方案,速度和可重复性,90,分钟出结果的一步检测可大大降低试验间的差异,可信的结果,高达,100%,病毒特异性,/,地址,5,个基因拷贝数的样本都能在一次反应中灵敏检测到,易于使用,即用型产品意味着最少的手工操作,甲型肝炎,病毒检测试剂盒,快速、准确、可靠的食源性病毒检测方案,甲型肝炎病毒检测方案,甲型肝炎病毒定量标准品,快速、准确、可靠的食源性病毒检测方案,戊型肝炎病毒检测方案,戊型,肝炎,病毒检测试剂盒,戊型肝炎病毒定量标准品,快速，准确，可靠的食源性病毒检测方案,门果病毒提取对照试剂盒,牡蛎中,G,型诺如病毒快速检测方法研究,目的：,建立,牡蛎中,G,型诺如病毒快速有效的检测方法，为食源性疾患疫情暴发的溯源提供可靠的实验室依据。,方法：,梯度,稀释含有,G,型诺如病毒的便悬液分别加入牡蛎消化道组织匀浆中，用蛋白酶,K,消化,PEG6000,沉淀,方法富集,后，实时荧光,T,PC, 进行终端检测，评估灵敏度及回收率,。,结果：,该,方法的灵敏度为,3,91 103 copies /g,，,病毒平均,回收率为,6,64%,。,结论：,该法操作,简单、快速，有望进一步优化后应用于不同贝类中,病毒的,检测。,北京市丰台区疾病预防,控制中心，,北京市疾病预防控制中心食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室,仪器平台：,ABI,7 500 Fast,图,1 G,诺如病毒绝对定量标准曲线,图,2,牡蛎,中诺如,病毒扩增,曲线,食品安全,转基因（,GMO,）检测,转基因的目的及监管的,重要性,在基因分子水平上利用现代生物技术，将某一生物体上的一个或者几个具有特定功能的基因转移到另一生物体，以获得人们所期望的生物品种或产品。,但是由于转基因技术潜在的不确定性,致使其安全性问题备受人们关注。 转基因食品是否含有毒素，从而对人体的健康造成损害？转基因食品是否会引起新的过敏性反应？转基因技术会不会增加人体对抗生素的耐药性？,世界各国立足于本国国情考虑到潜在风险,采取了相应的措施对转基因食品进行有效地监管。大致分为三派,:,以美国为代表的宽松派,;,以欧盟为代表的严格派,;,以日本为代表的折中派。,转基因食品问题是一个涉及生命科学、经济、法律、社会等方面的问题。,截取一段抗病基因,-,接入载体质粒,-,转入土壤杆菌,-,感染植物细胞,-,整合到细胞染色体,-,生成新植株,病原体,找出编码抗原,蛋白的基因,抗原基因,接入,载体质粒,带有病原基因的质粒,转入土壤杆菌,土壤,杆菌,转染植物细胞,植物细胞,整合到细胞染色体中,植物细胞,生成新植株,抗原基因,转基因,示意图,转基因产品,PCR,检测特异性比较,植物基因组,启动子,外,源目的,基因,终,止子,植物基因组,特 异 性,低,高,1),筛选,PCR,2),基,因特异性,PCR,3),结构,特异性,PCR,4,),品系特异性,PCR,1.,Isolate DNA,2. Combine sample with CeeramTools Assay,3.,Perform amplification on thermal cycler,4. Analyze results using,Real-Time PCR Sofftware,I,solate,DNA using,GMO Extraction Kit,from samples,Prepare the reaction,mix,35S Master Mix / TNOS Master Mix / P34S-FMV Master Mix / Plant Master Mix / General Master Mix,DNA sample,QS 12K, ViiA7,QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlus,R,eal-Time PCR,Sofftware,TaqMan GMO Screening Kit,Workflow,具体检测流程,以转基因玉米为例,SN/T1196-2012,制样,1,、称取,50,g,玉米样品,2,、,150,度干热预处理,2h,以灭菌,3,、,120,度、,30min,高压消毒处理的碾钵或粉碎机研磨至样品颗粒约 为,0.5mm,左右,模板,DNA,提取,1,、称取,1,g,玉米粉样,2,、,CTAB,法抽提,DNA,3,、或者用相应市售,DNA,提取试剂盒提取,DNA,实时荧光,PCR,检测,1,、设置对照：阴性目标,DNA,对照、阳性目标,DNA,对照、扩增试剂对照（水为模板）,2,、配置反应体系，每个样品做,2,个平行管,3,、设置反应程序,50,度，,2min,，,PCR,前去污染,95,度，,10min,，预变性,96,度，,15S,；,60,度，,1min,；,45,个循环,GMO,检测试剂盒,4,组双重,qPCR: P35S/CaMV, P34S/FMV, TNOS/A. tumefaciens,内源基因,/,内质控,滤膜法，大样品量（,10-15,克固体、,10mL,液体）,LOQ = 20 copies,LOD = 3 DNA copies, LOQ = 20 copies,TaqMan GMO Screening Kit, PN 4466334,TaqMan RR Soya Quantification Kit, PN 4466335,TaqMan Maize Quantification Kit, PN 4481972,LOD = 3 DNA copies, LOQ = 20 copies,GMO Extraction Kit (PN 4466336),仪器平台：,ABI 7500,GMO,大豆,荧光定量检测,某待检样品,大豆,内源基因：,lectin,（,+,）,转基,因元件：,CAMV35S, NOS, EPSPS,（,-,）,结果：未检出,CAMV35S, NOS,EPSPS,元件,Lectin CAMV35S NOS EPSPS,0.1%,转基因标准物质,大豆内源基因：,lectin,CT-24.2,转基,因元件：,CAMV35S CT-35.8,NOS CT-33.88,EPSPS CT-34.5,食品安全,肉源性成分检测,检测肉,源性成分的重要性,对研究者、消费者、食品工业和政策制定者等来说,食品的真伪都是一个热点问题,尤其是肉类工业。,2013,年初，数家超市和连锁餐厅出售的加工牛肉产品中发现马肉，造成一系列产品召回,肉类产品掺假和真伪一直是欧洲，中国和美国的头条新闻，造成了世界各地越来越多的加工肉类物种鉴定检测。,食品真伪鉴别，“牛肉膏”、“假猪蹄”，假肉歪风正起；牛羊成分使疯牛病风险倍增,严格意义来讲，这一类肉类掺假未必真会带来食品安全问题，但这种违法行为事实上打击了消费信心，也包含一些潜在风险，比如兽药滥用、动物疫病等。,市场上,3,大关注点,:,标签上的标注（配方）,OK,？,食品含不含猪肉（清真,/,犹太）？,素食产品含不含肉类？,从,5-20,g,样品进行均质,使用核酸提取试剂盒从,5-20,g,样品中抽提,DNA,1,、抽提核酸,使用,RapidFinder,物种,ID,试剂盒用荧光定量,PCR,方法检测,采用荧光定量,PCR,软件进行结果分析,2,、,肉源性成分定性检测,若结果阳性,用,RapidFinder,物种,ID,试剂盒和,RapidFinder,多重肉类定量试剂盒进行定量,分别进行肉类特异和通用动物反应,与试剂盒中标准品稀释产生的标准曲线进行比较,3,、肉源性成分定量,RapidFinder,Species ID and,Quant Multi-Meat Set,Workflow,肉源性成分具体检测及定量流程,-,以马肉检测为例,准备蛋白酶,K(,PK,),和,RNase.,设置加热块至,56C,，孵育器至,65C,在,50 ml,管中加入,10g,匀浆样品和,20ml,裂解液,1,65C,孵育,30 min,3500 g,离心,5 min,转移,385 L,上清液至,1.5 ml,离心管中，加,25 l,蛋白酶,PK,并混匀,56C,孵育,1 h,加入,400 l,裂解液,2.,混匀,. 70C,孵育,10 min,加入,420 l,乙醇，并混匀,转移,600 l,至过滤柱,.,1,1,000 g,离心,1 min.,弃废液,.,加入剩余样品，重复上一步,使用新的收集管,加入,500 l,洗涤液,1,，,11,000 g,离心,1 min.,弃废液,.,加入,600 l,洗涤液,2,，,11,000 g,离心,1 min.,弃废液，重复离心，并弃废液,将过滤柱放到新的,1.5 ml,离心管上，加入,50 l 70C,无菌水,.,室温孵育,3 min. 11,000 g,离心,1 min,收集,DNA,样品,.,核酸提取试剂盒,PN4466336,1,、抽提核酸,2,、荧光定量,PCR,定性检测,RapidFinder,马,肉,ID,试剂,盒,A15570,肉源性成分具体检测及定量流程,-,以马肉检测为例,1,、融,化预混液和阳性对照管，涡旋，置于冰上,.,2,、在,1.5 ml,离心管中，加入,:,7.5,l,马肉,预,混液,12.5,l,通用预混,液,5,l DNA,样品,（,10 ng/l,）,*,*,对照反应分别用阳性对照和水代替,3,、用,光学膜封板，或光学盖盖管，瞬时离心,4,、扩,增,:,5,、分析：靶标,= FAM,通道,. IPC = VIC,通道,Ctcut-off,= 3.32 + Ct,阳性对照,如,果,Ct,样品, Ctcut-off ,样品不含马肉,如,果,Ct,样品, Ctcut-off ,样品含有马肉,注意：每个样品做两个重复,!,没有检测到马肉,DNA,检测到马肉,DNA,样品中含有,PCR,抑制剂,样品中马肉,DNA,含量很高,肉源性成分具体检测及定量流程,-,以马肉检测为例,A,、梯度稀释物种（如马肉）标准品,注意：每个样品做两个重复,!,2,、荧光定量,PCR,定量检测,RapidFinder,物种,ID,试剂盒,RapidFinder,多重肉类定量试剂盒,+,1,、融化马肉和动物预混液,.,涡旋混匀后置于冰上。,2,、在,1.5 ml,离心管中,，,为每个样品，对照或标准品分别制备,2,个反应,：,7.5 l,马肉预混液,12.5 l,通用预混液,或,5 l,DNA,样品（,10 ng/l,）,*,*,对照反应中用稀释标准品或阴性对照替代,3,、用光学膜封板，或光学盖盖管，瞬时离心,4,、扩增：,5,、分析：,7.5,l,动物预混液,12.5 l,通用预混液,5 l,DNA,样品（,10 ng/l,）,*,RapidFinder,物种,ID,试剂盒,RapidFinder,多重肉类定量试剂盒,肉源性成分具体检测及定量流程,-,以马肉检测为例,动,物,马,肉,解,释,可,定量,不,可定量,样,品中没有检测到马肉或样品中检测到的马肉量低于定量下限,可,定量,可,定量,总,动物,DNA,中马肉,DNA,的量是,X%,不,可定量,不,可定量,样,品中检测到的马肉,DNA,和动物,DNA,均低于定量下限,动物源性成分检测产品,检测饲料,检测清真,/,犹太食品,在,AB,所有实时荧光定量,PCR,仪上都进行过优化,产品名称,货号,规格,物种名称,GMO,提取试剂盒,A15570,48 rxn,RapidFinder,牛肉,ID,试剂盒,A24391,48 rxn,牛,RapidFinder,猪肉,ID,试剂盒,A24392,48 rxn,野猪,RapidFinder,鸡肉,ID,试剂盒,A24393,48 rxn,原鸡,RapidFinder,火鸡肉,ID,试剂盒,A24394,48 rxn,吐绶鸡,RapidFinder,羊肉,ID,试剂盒,A24395,48 rxn,绵羊,RapidFinder,家禽肉,ID,试剂盒,A24397,48 rxn,许多禽类,包括原鸡（鸡），吐绶鸡（火鸡），绿头鸭（鸭），鸵鸟（鸵鸟），以及雁（鹅）,RapidFinder,反刍动物,ID,试剂盒,A24396,48 rxn,家牛,(,牛肉,),绵羊,(,羊,),山羊， 马鹿,(,赤鹿,),狍,RapidFinder,鱼肉,ID,试剂盒,A24398,48 rxn,大西洋鲑鱼,琵琶鱼,鳕鱼,狗鳕，大比目鱼，石斑鱼，鲚鱼，鳎目鱼，比目鱼，鲑鱼，虎鲨，欧洲鳗，赤刀鱼,RapidFinder,多重肉类定量试剂盒,A24399,48 rxn,物种检测,RapidFinder,肉类,ID,试剂盒,每个试剂盒,48,次反应,检测线粒体,DNA (,单拷贝区域,),试剂盒包含：,阳性对照,(,含,0.1%,靶标,DNA),靶标,DNA,预,混液,通用预混液,易于使用,:,实时荧光定量,PCR,无需电泳,可靠,:,内部阳性对照可以排除,PCR,过程中抑制剂的影响,灵敏度很高,:,鲜肉中检出下限为,0.01% (w/w),注意所有,RapidFinder,物种,ID,试剂盒循环条件相同,物种定量,RapidFinder,多重肉类定量试剂盒,每个试剂盒,48,次反应,检测线粒体,DNA (,16S,单拷贝区域,),试剂盒包含,:,定量标准品,多重肉类 预混液,通用预混液,与一个或多个,ID,试剂盒结合使用,牛肉，猪肉，马肉，家禽肉，鸡肉，火鸡肉,易于使用,:,实时荧光定量,PCR,无需电泳,可靠,:,内部阳性对照可以排除,PCR,过程中抑制剂的影响,灵敏度很高,:,鲜肉中定量下限为,0.0,5,% (w/w),结果,:,%,物种,DNA =,物种,DNA/,总的动物,DNA X 100,基于,TaqMan,技术进行肉类鉴定方案的优点,可靠和高特异,-Real-time PCR,无需电泳,灵活,-,在任何食品中，无论是生肉还是经过加工的肉类产品，特定肉类的,DNA,都能进行检测,准确,-,内部阳性质控,(IPC),用以排除,PCR,抑制剂带来的干扰,快速,-,一天之内，从样品到结果,设计和开发的合作伙伴,-,Life Technologies,公司与全球的客户进行合作，设计、研发优异性能的,PCR Assay,进行肉类鉴定和其他食品安全的检测,检品：牛肉丸,仪器：,ABI 7500,肉类鉴定试剂盒：,RapidFinder Beef/Chicken/Pork ID Kit,应用案例：牛肉丸中肉源性成分鉴定,公共卫生,流感病毒检测,埃博拉病毒检测,严重急性呼吸道症候群（,SARS,）,生物安全病原体检测,人兽共患病对公共卫生安全的影响及监测重要性,目前,全世界已证实的人畜共患病约,250,多种，由联合国确定的在公共卫生方面具有重要意义的人畜共患病有,90,种，其中目前在许多国家流行，危害严重的人畜共患病有近,40,种。,危,害人体健,康：如,狂犬病、炭疽病、禽流感、鼠疫、猪丹毒、布氏杆菌病、结核病等，对人的感染很高，身体健康受到严重损害。,危,害畜牧业安全生,产：造,成大批畜禽死亡,；生,产性能下降，淘汰率提高，使用寿命短,；大,量畜禽产品废弃，既影响了环境，也降低了效益,；影,响消费者心理，造成恐慌，从而造成养殖户收入下降，养殖业难以发展，畜牧业生产不景气。,危,害畜产品安全和公共卫,生,人,畜共患病的一个重要传播渠道就是食入感染。因此，食源性病原微生物是畜产品安全的一个重要内容,。畜,禽中很多人畜共患病没有得到净化，成为食源性病原微生物的主要来源,。,流感病毒通用检测流程,采,用,H7N9,病毒检测试剂盒，通常情况下可在,3-5,小时内检测出样本是否为,H7N9,病毒。,荧光定量,PCR,技术可以对来源广泛的样本的多种疫病病毒核酸进行自动检测。,该方法能够提供其他检测方法无法比拟的快速、简便和准确的优点。,流感样病例,抗病毒治疗,甲型流感病毒抗原快速检测,采集呼吸道标本,核酸检测、病毒分离,阳性,阴性,抗病毒治疗,阳性,阴性,确诊病例,排除人类感染,H7N9,禽流感,流感病毒核酸检测流程（,Real Time-PCR,）,1,、样品处理及核酸抽提,2,、配置,PCR,反应体系,3,、设置程序并运行,RT-PCR,实验,4,、数据分析,I,solate,RNA using Nucleic Acid Extraction Kit from samples,Prepare the reaction,mix,Master Mix,RT-PCR enzyme mix,RNA sample,QS 12K, ViiA7,QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlus,R,eal-Time PCR,Sofftware,核酸提取试剂盒,AM1836,1,、抽提核酸,具体检测流程,-,以甲型流感病毒（,H7N9,）为例,1,、试剂准备,1,.1,把,Carrier RNA,加入到,Lysis/Binding Solution，,混合后加入异丙醇，配制成裂解,/,结合液。混合完成后，存放于室温。,a,混合下列两种试剂,每,个反应,整,瓶,Lysis/Binding,Solution Concentrate,65,l,8ml,Carrier,RNA,1,l,125,l,b,混合片刻，然后加入异丙醇,65,l,8ml,1,.2,加入,12,ml,异丙醇到,Wash Solution 1，,存放于室温，配制成洗涤液,1,。,1,.3,加入,32,ml,已醇（酒精）到,Wash Solution 2，,存放于室温，配制成洗涤液,2,。,1,.4,准备,Bead Mix,（磁珠混合液）：每个反应需要,20 l,磁珠混合液，尽管该混合液可以在,4,放置,2,星期，我们仍然推荐您在实验当天配制新鲜的磁珠混合液。配制方法如下：,成,分,每,个反应,96,个反应（,+ 10%,）,RNA,Binding Beads,10,l,1.1ml,Lysis/Binding,Enhancer,10,l,1.1ml,注,意：我们推荐多准备,10%,的试剂来避免加样误差。,磁,珠混合液配置好后，,放 置,于冰上，直到使用。,MagMax24,自动化核酸提取仪,+,核酸提取试剂盒,AM1836,1,、抽提核酸,具体检测流程,-,以甲型流感病毒（,H7N9,）为例,2,、运行机器，抽提病毒,RNA,2.1,接通电源，打开开关。,2.2,按照下表要求将样品和试剂加入专用,8,联管中,2,.3,放置专用样品板到托板上。,2,.4,在磁头套滑槽中插入磁头套。,2,.5,在前控制面板上选择合适的程序。,2,.6,按,START,键。,2,.7,运行结束后移除样品板和磁头套。,MagMax24,自动化核酸提取仪,+,2,、荧光定量,PCR,定性检测,自行合成引物探针，采用通用预混液,(,AgPath,one-step RT-PCR kit,),进行检测,配置,PCR,反应体系,1,、室温融,化预混,液、引物、探针，,涡旋，置于冰,上备用,2,、在,0.2,ml,离心管,中按下表配置反应体系，,加入,:,Components,volume（,L）,2, RT-PCR Master Mix,12.5,primer-forward（40,M）,0.5,primer-reverse（40,M）,0.5,Probe,（20,M）,0.5,25xRT-pcr,enzymes mix,1,Template,RNA,5.0,RNase,Free H2O,5,Total,25,注：不同的引物对和探针加在不同的反应管中，采用阳性和阴性对照反应,3,、用,光学膜封板，或光学盖盖管，瞬时离心,4,、扩,增,:,45, 10min,；,95, 10min,；,95, 15s,、,60, 45s,；,40Cycles,5,、分析,：,如,果,Ct,样品, Ctcut-off ,阴性,如,果,Ct,样品, Ctcut-off ,阳性,具体检测流程,-,以甲型流感病毒（,H7N9,）为例,WHO,推荐使用,AgPath one-step RT-PCR,kit,（,AM1005,）,人传染病检测,类,别,货号,品名,包装大小,核酸抽提,AM1836,MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit,96,反应,AMB1836-5,5x MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit,5 x 96,反应,4462359,5x MagMAX Pathogen RNA/DNA Kit,5x 96,反应,AM1939,MagMAX Viral RNA Isolation Kit,50,反应,通用预混液,AM1005,AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit,100,反应,H1N1pdm,4456927,Pandemic H1N1/09 Assay Set v2.0,1000,反,应,4456926,Pandemic H1N1/09 Assay Controls v2.0,200,反,应,甲型流感,4415200,VetMAX,TM,-Gold SIV Detection Kit,100,反应（,25uL,）,冻干粉,A/H5/H7,4398276,VLA TaqMan Influenza A Detection Kit,96,反应,4398277,VLA TaqMan Influenza H7 Subtyping Kit,96,反应,4398312,VLA TaqMan Influenza H5 Subtyping Kit,96,反应,神经氨酸酶活性,4457091,NA-Fluor,TM,Influenza Neuraminidase Assay Kit,960,反应,4457535,NA-XTD,TM,Influenza Neuraminidase Assay Kit,960,反应,客户定制产,品,(,引物探针混合液,),4466628,TaqMan H1N1pdm/FluB/H1/H3 4-plex,Assay,流感,4,重,100,反应（,25uL,）,TaqMan,FluA,/H5/H9 triplex Assay,禽流感,3,重,100,反应（,25uL,）,4401512,TaqMan Norovirus Assay*,诺如病毒,100,反应（,30uL,）,TaqMan,Candida albicans Assay*,白色念球菌,(DNA),100,反应（,30uL,）,* 带,IPC,内质控,猪流感通用型试剂盒对甲型流感覆盖率最高,生物安全检测,类,别,货号,品名,包装大小,核酸抽提,AM1840,MagMAX-96 Total NA Isolation Kit,100,反应,检测试剂,4382490,TaqMan,Francisella tularensis,Detection,Kit,土拉热杆菌,100,反应,4382486,TaqMan,Bacillus anthracis,Detection,Kit,炭疽杆菌,100,反应,4382423,TaqMan,Brucella,spp. Detection,Kit,布鲁氏菌,100,反应,4382488,TaqMan,Yersinia pestis,Detection,Kit,鼠疫,100,反应,禽流感亚型,H7N9,的荧光定量,PCR,检测,仪器平台：,7500,目的：,建立,一种快速准确的检测埃博拉病毒（）亚型的方法,。,方法：,根据,中公布,的,基因序列，设计引物和探针，通过优化反应条件，,建立一,种检测扎伊尔亚型和苏丹亚型的一,步法,荧光定量,方法。,结论：,本文,将荧光定量技术用于埃博拉病毒的定量检测中，并且建立了扎伊尔亚型和苏丹亚型,荧光定量,检测方法，具有一定的创新性。该方法的建立对加快我国诊断技术的研究具有重要推动作用。,一步法荧光定量,-,检测埃,博拉病毒扎伊尔亚型和苏丹亚型方法的,建立,一步法荧光定量敏感性试验线性,扩增曲线,一步法荧光定量特异性试验线性,扩增曲线,动物传染病的控制,动物健康,动物疫病的危害性及监测的重要性,动,物疫病引起大批动物死亡，造成巨大经济损,失，引,起动物生产性能下,降,动,物疫病的防疫消,耗大,量财,富,动,物疫病的发,生日,趋严重,，成,为长期制约我国畜牧业发展,、阻,碍畜,产品,国际贸易的重要因素，并可能成为引起公共食,品安,全事件以及危害人民身体健康的重要隐患,。,人兽共患疾病威胁人类健康,优先防治的,国内动物疫病,一类动物疫病,（,5,种）,口蹄疫（,O,型、亚洲,型、,A,型）,高致病性禽流感,高致病性猪蓝耳病,猪瘟,新城疫,二类动物疫病,（,11,种）,布鲁氏菌病（共患）,奶牛结核病,狂犬病,猪伪狂犬病、经典猪蓝耳病,马传贫和沙门氏菌等,11,种动物疾病,我国方针政策,国家中长期动物疫病防治规划（,20122020,年,),农业部公告 第,1125,号 附件（,2008,年,12,月,11,日）,一、二、三类动物疫病病种名录,荧光定量,PCR,技术对动物疫病的检测策略,样本处理及核酸抽提,采样,DNA,病原,RNA,病原,PCR,扩增，通过,CT,值判定结果的阴阳性,RT-PCR,扩增，通过,CT,值判定结果的阴阳性,磁珠法,自动,化核酸提取仪，同时高效抽提,DNA,与,RNA,1,、采用市售的检测试剂盒，进行检测,2,、,采用荧光定量,PCR,预混液，合成引物探针，进行检测,1.,Isolate RNA,2. Combine sample with CeeramTools Assay,3.,Perform amplification on thermal cycler,4. Analyze results using,Real-Time PCR Sofftware,I,solate,RNA using Nucleic Acid Extraction Kit from samples,Prepare the reaction,mix,Master Mix,RT-PCR enzyme mix,RNA sample,QS 12K, ViiA7,QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlus,R,eal-Time PCR,Sofftware,Taqman,蓝耳病,病毒,(,PRRSV),一步法试剂盒,Workflow,猪病检测试剂盒,-,Taqman,蓝耳病,病毒,(,PRRSV NA/EU),快速、 高效地检测蓝耳病，同时报告北美和欧洲型分型结果，在,1.5,小时内得到定量结果。,一步法定量,RT-PCR,节省时间，操作大大简化，将交叉污染降低到最低限度。,特异性高，非常灵敏，能稳定检测出低于,40,个,RNA,分子。,利用人工合成的,Xeno RNA,作为内参照监控每一个反应，避免假阴性报告,猪病检测试剂盒,-,VetMAX Gold,猪流感,病毒,(Swine Influenza Virus),检测试剂盒,包含所有检测所需的试剂。,经过美国农业部严格论证和注册。,快速定量检测，,1.5,小时内获得实验结果。,实验结果高度重复性、标准化，减少不稳定的差异结果。,Xeno RNA,阳性内质控，鉴别因逆转录或,PCR,抑制因子和人为操作导致的假阴性结果。,牛病检测试剂盒,-,Taqman,牛病毒性腹泻病毒,(,BVDV),高度的特异性和敏感性：,1-10,个病毒,RNA,分子，能稳定检测到少于,40,个病毒,RNA,分子。,快速、高效，在,1.5,小时内得到定量结果。,检测灵敏高，可以混合多个样本后检测，大大降低每个样品的检测成本。,一步法定量,RT-PCR,节省时间，操作大大简化，将交叉污染降低到最低限度。,从,RNA,分离到定量,RT-PCR,都可轻松自动化，快速处理大量样品。,利用人工合成的,Xeno RNA,作为内标监控每一个反应，避免假阴性报告。,动物健康快速检测,系统,猪蓝耳病病毒,(PRRSV),猪肺炎支原体,(M. hyopneumoniae),猪,瘟病毒,(CSFV),猪流感病毒,(SIV),禽流感,病毒,(AIV),新城,疫病毒,(NDV),马流,感,病毒,(EIV),牛病毒性腹泻病毒,(BVDV),牛蓝舌病病毒,(BTV),牛副结核病毒,(MAP),牛胎毛滴虫,(T. foetus),牛呼吸道合胞体病毒（,BRSV),牛疱疹病毒,牛鼻气管炎（,IBR/BHV-1),感染性三文鱼,贫血症病毒,(ISAV),病毒,性出血败血症病毒,(VHSV),传染,性造血组织坏死病病毒,(IHNV),锦,鲤抱枕病毒,(KHV),白,板综合征病毒,(WSSV),黄头病毒,(YHV),桃拉综合,征病毒,(TSV),传染,性鸡肉坏死病毒,(IMMV),传染,性皮下及造血组织坏死病毒,(IHHNV),基于,TaqMan,探针的牛布氏杆菌,实时荧光,定量,PCR,的特异性鉴定,目的：,根据牛布氏杆菌,BM28,保守序列设计引物和探针，建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的,TaqMan,实时荧光定量,PCR,方法,。,以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品，进行定量,PCR,反应。结果显示：,5.010,5,5.010,1,拷贝范围内定量,PCR,均有“,s,”型扩增曲线，检测灵敏度为,50,拷贝每微,升。,本,研究建立的实时荧光定量,PCR,方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性，在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景,。,5,个稀释度的范围内定量,PCR,有,s,型扩增曲线，发现指数增长期的曲线平行，反映了,PCR,的扩增效率相近；而不同稀释度之间的,Ct,值相差均匀，符合定量,PCR,的,Ct,值与起始拷贝数之间严格的线性关系，因此，样本拷贝数与,Ct,值之间有良好的,相关性,。,检测的,R,2,值达到,0.999,。因此，标准曲线在,5.010,5,5.010,1,拷贝每微升范围内呈现良好的线性关系，表明本实验绘制的标准曲线可以达到试验,要求。,目的,:,建立二重荧光定量,RT- PCR,方法,用于禽流感病毒,(,AIV),和新城疫病毒,(,NDV),的检测,。,方法,:,根据,AIV,和,NDV,的基因保守序列,设计了,AIV,和,NDV,的,2,对特异性引物和,2,条用不同荧光基团标记的,TaqMan,探针,;,对反应条件,和试剂,浓度进行优化,建立了能够同时检测,AIV,和,NDV,的二重荧光定量,RT- PCR,方法,。,结论,:,建立了用于,检测,AIV,和,NDV,的二重荧光定量,RT- PCR,法,该方法特异、敏感、快速、可定量,对,AIV,和,NDV,的防制有重要意义。,禽流感和新城疫病毒二重荧光定量,RT- PCR,检测方法的建立,Thank you for your attention,