第十四章 维生素类药物分析

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 9,维生素类药物的分析,维生素：,是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物质。,人体不能合成维生素。,发现简史,公元前3500年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来 的维A。,1600年-医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。,1747年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维C。,1831年-胡萝卜素被发现。,1905年-甲状腺肿大被碘治愈。,1911年-波兰化学家丰克为维生素命名。,1915年-科学家认为糙皮病是由于缺乏某种维生素而造成的,1916年-维生素B被分离出来。,1917年-英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病，随后断定这种病是 缺乏维D引起的。,1920年-发现人体可将胡萝卜转化为维生素A。,1922年-维E被发现。,1928年-科学家发现维B至少有两种类型。,1933年-维E首次用于治疗。,1948年-大剂量维C用于治疗炎症。,1949年-维B3与维C用于治疗精神分裂症。,1954年-自由基与人体老化的关系被揭开。,1957年-Q10多酶被发现。,1969年-体内超级抗氧化酶被发现。,1970年-维C被用于治疗感冒。,1993年-哈佛大学发表维生素E与心脏病关系的研究结果,必需维生素 13种,维生素A，维生素B，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K，维生素H（生物素），维生素P，维生素PP，维生素M，维生素T，维生素U，水溶性维生素。,必需维生素？,外源性：人体自身不可合成，需要通过食物补充；,微量性：人体所需量很少，但是可以发挥巨大作用；,调节性：维生素必需能够调节人体新陈代谢或能量转变；,特异性：缺乏了某种维生素后，人将呈现特有的病态。,VitA、D,2,、D,3,、 E、K,1,等,脂溶性,水溶性,VitB族(B,1,、B,2,、B,6,、B,12,),VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺,分类：,VitM,VitPP,常见维生素的生理活性,维生素A：有VA,1-3,，其中VA,1,活性最高，又称为视黄醇；维生素A是眼睛中,视紫质,的原料，也是皮肤组织必需的材料，人缺少它会得干眼病、夜盲症等。,对人体的生长、视觉和生殖功能都很重要 。,维生素D：又称钙化醇，与钙、磷代谢及植物神经系统、内分泌及血管系统有密切关系，具有皮质类固醇激素样作用。可用于治疗异位性,皮炎,、,红斑狼疮,、斑秃、聚合性痤疮、泛发性脓疱性银屑病等 ；与晒太阳有关。,维生素E可用于治疗冻疮、多形红斑、结节性红斑、单纯性,紫癜,、色素性紫癜性,皮肤病,、肢端紫绀症、痛经以及治疗抑郁症。,维生素K促进肝脏合成凝血酶原及血浆因子，与皮质类固醇激素有协同作用。可用于治疗紫癜、慢性,荨麻疹,、淋巴瘤伴皮肤瘙痒病等。,维生素B1可用于治疗,湿疹,、皮炎、脓皮病、念珠菌病、光感性皮肤病、带状,疱疹,后遗神经痛、多发性神经炎等。,维生素B2可用于治疗脂溢性皮炎、脂溢性,脱发,、寻常痤疮、酒渣鼻、寻常须疮、口周湿疹、日光性皮炎等。,维生素B6可用于治疗脂溢性皮炎、脂溢性脱发、寻常痤疮、酒渣鼻、湿疹、渗出性银屑病、神经性皮炎、妊娠痒疹、斑秃、唇炎等。,维生素B12是体内多种代谢过程中必需的辅酶，参与核蛋白的合成，甲基的转换以及脂肪和糖的代谢，可用于治疗慢性荨麻疹、接触性皮炎、早期银屑病、,扁平疣,、水痘、带状疱疹、扁平苔癣、脂溢性皮炎、光感性皮肤病等。,维生素C主要用于抗炎和抗衰老，可用于治疗紫癜性皮肤病、湿疹、荨麻疹、,黄褐斑,、黑变病、特发性斑状色素沉着、早期银屑病、砷剂皮炎等。,-H 维生素A醇,-COCH,3,维生素A醋酸酯,-COC,15,H,31,维生素A棕榈酸酯,R :,第一节 维生素A的分析,全反式,（一）为一个具有共轭多烯侧链的环己烯,1. 具有UV吸收,结构与性质,一、,维生素A 325.5 100% 全反式,新维生素Aa 328 75% 2顺,新维生素Ab 320.5 24% 4顺,新维生素Ac 310.5 15% 2，4顺,异维生素Aa 323 21% 6顺,异维生素Ab 324 24% 2，6顺,相对生物效价,顺反异构,VitA2,VitA,3,3,.易发生脱氢、脱水、聚合反应,鲸醇,或有金属离子存在时氧化,临床使用时成酯后，溶于植物油中；阴凉干燥处保存，还需加入,N,2,或一定抗氧剂提高稳定性。,共轭多烯侧链 易被氧化,（二）,环氧化物,VitA醛,VitA,酸,（三）,与三氯化锑发生呈色反应,CHCl,3,溶解性,（四）,不溶于水，微溶于乙醇；,易溶于有机溶剂和植物油等,(五)紫外吸收特征,共轭多烯紫外吸收；,325328nm范围内有最大吸收，可用于鉴别和定量测定；,三氯化锑反应,（一）,条件： 无水、无醇,CHCl,3,鉴别试验,二、,SbCl,3,水,SbOC,l,乙醇可使碳正离子的正电荷消失,蓝色,紫红,max,为326nm,一个吸收峰,UV法,（二）,max,为350390nm,三个吸收峰,去水VitA（VitA,3,）,VitA,USP 显色剂 磷钼酸,规定斑点颜色和Rf,值,BP,对照品法,显色剂 三氯化锑,TLC法,（三）,立体异构体,氧化产物及光照产物,合成中间体,去氢维生素A（ VitA,2,）,去水维生素A（ VitA,3,）,UV法（三点校正法）,（一）,含量测定,三、,三点校正法,1. 前提条件：,（1）杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；,（2）物质对光的吸收具有加和性。,测定对象：,VitA醋酸酯,第一法 等波长差法,第二法 等吸收比法(皂化法),测定对象：VitA醇,2. 波长的选择：,（1）,1 VitA的max（如VitA酯 328nm）,（2）,2 3,分别在,1的两侧各选一点,第二步：求,3、测定法,（1）基本步骤:,第一步：A选择，A328测定或A328校正,第三步 求效价,第四步：求标示量,A*D*换算因数*W,W*100*标示量,100,换算因数：,单位E,1cm,数值所相当的效价数,（由纯品计算而得）,方法：,（2）,第一法,维生素A醋酸酯,判断 是否在,326,329nm,之间,改用第二法,是,否,求算,并与规定值比较,规定值 差值,判断差值是否超过,0,3%,15%,3%,第二法,第二法,计算,A,328,（,校正）,用,A,328,计算,有超过,无超过,f,VitAD胶丸中VitA的含量测定,精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量丸）的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,A,300,A,316,A,328,A,340,A,360,A,300,/A,328,A,316,/A,328,A,328,/A,328,A,340,/A,328,A,360,/A,328,：0.299,求本品中维生素A的含量？,A,300,/A,328,A,316,/A,328,A,328,/A,328,A,340,/A,328,A,360,/A,328,0.555,0.907,1.000,0.811,0,=,=,=,=,=,适用于维生素A醇,（等吸收比法）,第一法无法消除杂质干扰时用此法, 皂化法、6/7A法 ,（3）第二法,水溶性,脂溶性,判断,max,是否在,323,327nm,之间,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算,是,否,判断,A,300,/A,325,是否大于,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算,A,325,(,校正,),0,3%,3%,f,三氯化锑比色法,（二）,优点： 简便 快速,max,618nm620nm,标准曲线法,缺点：,呈色不稳定 （5 10s内）,水分干扰,与标准曲线温差1,专属性差,三氯化锑有腐蚀性,（,三）高效液相色谱法,流动相：正己烷异丙醇（997,3）,检测波长：325nm,第二节 维生素B,1,的分析,一、结构与性质,(1)易溶于水,(2)水溶液呈酸性,共轭双键,max,= 246,nm,二、性质,杂原子的反应，能与某些生物碱沉淀试剂反应，生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别和含量测定。,6.硫元素反应：与NaOH共热，形成硫化钠，硝酸铅生成黑色沉淀；,专属性反应,二、鉴别试验,（一）,硫色素反应,硫色素,2H,VitB,1,H,+,H,+,H,+,H,+,（二）,沉淀反应,S元素反应,Cl,-,反应,（三）,其他反应,H,+,三、含量测定,喹那啶红亚甲蓝,(紫红天蓝),（一）,非水溶液滴定法,UV法,（二）,片剂、注射剂,= 421,（每片）相当于标示量的,%=,A = ECL,ChP,1,1,标示量,%,W,E,A,%,cm,100,D,100,平均片重,（每ml）相当于标示量的,标示量,%,V,E,A,%,cm,100,D,100,注意,维生素1的紫外吸收峰随溶液的pH变化而不同：时，最大吸收波长在246nm处；时，2个吸收峰：232233和266；,可采用差示分光光度法测定其含量；,NaOH,（三）,硫色素荧光法：维生素B1的专属性反应,原理,1、,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇,+ NaOH + 异丁醇,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇,+ NaOH + 异丁醇,S,d,A,b,对照液,供试液,d,S,b,A,C,样,-,-,=,C,标,特点,3、,（1）灵敏度高，线性范围宽,（2）专属性强，氧化产物及代谢产物不干扰，可用于制剂分析，体液分析等。,硫色素荧光法特点,为维生素B1的专属性反应，可用于维生素B1及制剂的含量测定；,不受氧化破坏产物的影响，结果较准确；但操作比较复杂，受干扰因素多；,氧化剂除了铁氰化钾外，还可以使用氯化汞或者溴化氰；,第三节 维生素C的分析,L抗坏血酸,结构与性质,一、,（一）结构,二烯醇,内酯,两个手性碳（C,4,C,5,）,C,3,OH的,pKa,C,2,OH的,pKa,一元酸,（二）性质,1、易溶于水,2、水溶液呈酸性,L(+)抗坏血酸,活性最强,手性C（C,4,、C,5,）,*,*,有活性,有活性,无活性,二烯醇结构,与碱反应,糖类的显色反应,50,结构与糖类相似,特征,nm,nm,max,OH,max,H,265,l,243,l,-,+,利用还原性：与氧化剂的反应,鉴别试验,二、,（一）与AgNO,3,反应,（二）与2，6 - 二氯靛酚反应,氧化型,玫瑰红色,还原型,蓝色,OH,（,玫瑰色）,（无色）,与碱性酒石酸铜反应,USP,与KMnO,4,反应,（三）与其他氧化剂反应,（四）糖类的反应,（蓝色）,(糠醛),（戊糖）,50,(吡咯),BP,HCl,（五）UV,三、杂质检查,（一）溶液的澄清度与颜色检查,（二）铁、铜离子的检查,维生素C原料药,片 剂,注射剂,维生素C原料药,糠醛缩合呈色,催化V,c,氧化分解,原子吸收法,(三)草酸的检查,草酸与金属离子作用形成沉淀；所以对Vc的原料，尤其是注射液，要进行草酸检查；,加入CaCl,2,，比浊法；,指示剂 淀粉指示液,（一）碘量法,四、含量测定,原理：利用V,c,强的还原性,H,+,取本品约，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于的C,6,H,8,O,6,。,2、方法,原料药,（2）酸性环境 稀醋酸,（1）,新沸冷H,2,O,减慢VitC被O,2,氧化速度,（3）立即滴定,赶走水中O,2,减少,O,2,的干扰,3、讨论,片剂 过滤,注射剂,抗氧剂,丙酮,甲醛,Na,2,SO,3,NaHSO,3,Na,2,S,2,O,3,Na,2,S,2,O,5,C,H,H,O,O,a,S,3,a,S,O,+,H,2,N,H,O,N,2,2,5,2,H,O,N,H,C,O,S,3,a,(二)2，6 - 二氯靛酚滴定法,1、原理,2、方法,自身指示终点法,（2）快速滴定 2min内,（1）酸性环境 HPO,3,-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,（3）亦可剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,3、讨论,（4）缺点,需经常标定,贮存一周,不稳定,专属性强，多用于含 V,c,的制剂和食品的分析,（5）优点,（三）,高效液相色谱法,血浆中维生素C的测定,标准溶液包括样品预处理过程均需加入偏磷酸，偏磷酸同时可用于血样中的蛋白沉淀；当天取血当天测定；处理好的样品亦需冰箱保存,第四节 维生素D的分析,一、结构与性质,（一）结构,维生素 D,2,(麦角骨化醇),维生素D,3,(胆骨化醇),1.性状 无色针状结晶或白色结晶性粉,末；无臭，无味。,2.溶解性 宜溶于有机溶剂，在植物油中,略溶，在水中不溶。,3.不稳定性 含有多个烯键，所以极不稳,定，宜氧化变质，效价降低，,毒性增强。,（二）性质,4旋光性 维生素D2 6个手性碳原子,维生素D3 5个手性碳原子,5显色反应 甾类化合物,氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色,6紫外吸收特性,无水乙醇 265nm,维生素D2 为460490,维生素D3 为465495,醋酐,硫酸,E,1cm,1%,E,1%,1cm,二、鉴别试验,（一）显色反应,1与醋酐-浓硫酸反应,氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色,醋酐,硫酸,2与三氯化锑反应,本品,1,2-二氯乙烷,三氯化锑试液,橙红色,粉红色,3其它显色反应,维生素D,三氯化铁,橙黄色,二氯丙醇,乙酰氯,绿色,（二）比旋度鉴别,无水乙醇溶液,维生素D,2,比旋度为102.5至107.5,维生素D,3,比旋度为105至112,（,三）其它鉴别方法,薄层色谱法、HPLC法,制备衍生物测熔点,紫外、红外吸收光谱,（四）维生素D,2,、D,3,的区别反应,维生素D,2,维生素D,3,96%乙醇,10ml,取,乙醇1ml,和85%硫酸5ml,红色,max,570nm,黄色,max,495nm,三、杂质检查,（一）麦角甾醇的检查,维生素D,2,90,%乙醇溶液,洋地黄皂苷溶液,不得发生浑浊或沉淀,（二）前维生素D的光照产物,四、含量测定,正相高效液相色谱法,（一）维生素D测定法,含量以单位表示,每单位相当于维生素,g,注意：计算的是维生素D及前维生素D经折,算成维生素D的总量,测定在半暗室及避免氧化的情况下进行,第一法：无干扰杂质,第二法：有V,A,及其他杂质干扰,第三法：用第二法时，前 V,D,峰受杂质干扰,仅V,D,峰可分离,第一法,内标物：邻苯二甲酸二甲酯,色谱条件及系统适用性试验：,填充剂：硅胶,流动相：正己烷-正戊醇（997：3）,检测波长：254nm,无干扰杂质,维生素D,3,光照,前维生素D3,反式维生素D3,维生素D3,速甾醇D3,与维生素D3的比保 留 时 间,分离度,溶液组成,先后进样5次，维生素D3 峰面积的 RSD2.0 %,系统适用性试验,校正因子测定：,维生素D的校正因子:,f,1,=A,s,m,i,/A,i,m,s,前维生素D折算成维生素D的校正因子:,f,2,=,（,A,s,m,r,-f,1,m,s,A,r1,）/（,A,r2,m,s,）,含量测定：计算维生素D及前维生素D折算成,维生素D的总量,m,i,=（,f,1,A,i1,+f,2,A,i2,）m,s,/A,s,第二法,第一步：皂化提取,供试品,OH,-,加热回流,冷却,乙醚提取,乙醚提取液,挥干乙醚,残渣,甲醇溶解,供试溶液A,有V,A,及其他杂质干扰,第二步：分离收集,供试品溶液A,RP-HPLC,维生素D,前维生素D,维生素A及其他杂质,叠峰,分离,收集,供试品溶液B,维生素D及前维生素D,第三步：按第一法进行含量测定（内标法）,挥干,内标的正己烷溶液,溶解,第三法,第一步：皂化提取,同第二法得供试品溶液A,第二步：,供试品溶液A,RP-HPLC,维生素D,前维生素D,维生素A及其他杂质,叠峰,分离,供试品溶液C,收集,挥干,异辛烷溶解,90、,挥干,正己烷溶解,前维生素D,维生素D,第三步：用第一法色谱条件按外标法计算含量,用第二法时，前 V,D,峰受杂质干扰,苯并二氢吡喃醇,第五节 维生素E的分析,一、结构与性质,（一）结构,名 称,R,1,R,2,相对活性,-,生育酚,-,生育酚,-,生育酚,-,生育酚,CH,3,CH,3,H,H,CH,3,H,CH,3,H,1.0,0.5,0.2,0.1,*,*,*,生物效价,右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10,（天然品）,（合成品）,dl,生育酚醋酸酯,（二）性质,1、溶解性：易溶于有机溶剂，不溶于水,4、UV：乙醇溶液中UV284nm,2、水解性：酯键易水解,3、氧化性：无氧条件下十分稳定，200度也不被破坏；,7515,（一）,硝酸反应,橙红色,二、鉴别试验,（橙红色）,生育红,生育酚,HNO,3,强氧化剂,三氯化铁联吡啶反应,O,（二）,生育酚,对-生育醌,红色,Fe,3+,O,max,= 284nm,min,= 254nm,0.01%无水乙醇中,UV法,（三）,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）,显色剂 硫酸（105, 5）,VitE R,f,TLC法,（四）,（二）生育酚,硫酸铈滴定液（）,二苯胺（亮黄灰紫）,利用游离生育酚的还原性，,将硫酸铈还原成硫酸亚铈,三、杂质检查,（一）酸度,游离醋酸,(三)有关物质的检查,(四)残留溶剂：环己烷的检查,四、含量测定,GC法,（一）,GC特点,1、,选择性好,灵敏度高,速度快,分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化。易受样品蒸气压限制,载气N,2,固定液,硅酮（OV-17）,担体硅藻土或高分子多孔小球,柱温265,检测器氢火焰离子化检测器(FID),内标正三十二烷,n 500,R2,内标法加校正因子定量,2、VitE测定的色谱条件,内标法,供试液（样品+内标）,内标物,对照液（对照+内标）,是样品中不存在的物质,与被测组分峰靠近,能与各组分完全分离,与被测组分的量接近,样品 dl,生育酚,固定相,十八烷基硅烷键合硅胶,流动相甲醇-水（49 ：1）,检测波长292nm,R,RSD0.8%,（二）RP - HPLC法（外标法）,（三）荧光分光光度法,对照品 dl,生育酚,在220400nm波长范围内，以发射、激发波长间隔,为,40nm,扫描同步荧光光谱，测定同步荧光峰的荧光强度信号值。,V,E,=,F,样品,-,F,空白,F,标准,-,F,空白,（mg/L),第六节 复方制剂中多种维生素的分析,一、离子对HPLC法测定多种维生素,以樟脑磺酸作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠作为抗氧剂,二、反相HPLC法同时测定9种水溶性维生素,三、非水反相HPLC法同时测定4种脂溶性维生素,