药品生物检定技术

Textmasterformate durch Klicken bearbeiten,Zweite Ebene,Dritte Ebene,Vierte Ebene,Fnfte Ebene,Klicken Sie, um das Titelformat zu bearbeiten,Page,58,全国高职高专药品类专业第二轮规划教材,药物分析,Textmasterformate durch Klicken bearbeiten,Zweite Ebene,Dritte Ebene,Vierte Ebene,Fnfte Ebene,Klicken Sie, um das Titelformat zu bearbeiten,第,八章 药品生物检定技术简介,药品生物检定技术是指利用生物体（微生物、细胞、离体组织或动物）对药物的特定药理、毒理作用，来测定生物药品的效价、检查药品中的有害物质以及对制剂进行微生物限度或无菌检查的技术方法,无菌检查,微生物限度检查,抗生素效价的微生物检定法,生化药物效价的生物测定法,药品的安全性检查,第,一,节,无菌检查,概述,无菌检查法,系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否,无菌,的一种方法。,将药品或材料，在严格的无菌操作条件下，接种于适合各种微生物生长的不同培养基中，置于不同的适宜温度下培养一定的时间，逐日观察微生物的生长情况，并结合阳性和阴性对照试验的结果，判断供试品是否无菌。,包括,薄膜过滤法,和,直接接种法,两种方法,一、常规技术要求,1.,应在环境洁净度,10000,级以下的,局部洁净度,100,级的单向流,空气区域内或隔离系统中进行检查。,2.,全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。,3.,单向流空气区、工作台面及环境应定期按,医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法,的现行国家标准进行洁净度验证。,二、培养基,（一）培养基的种类：,7,种,硫乙醇酸盐流体培养基（需氧菌、厌氧菌培养基）,改良马丁培养基（真菌培养基）,选择性培养基,0.5%,葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）,营养肉汤培养基,营养琼脂培养基,改良马丁琼脂培养基,二、培养基,（二）培养基的适用性检查,证明,：培养基无菌，且能保证细菌生长良好,1.,无菌性检查,无菌性检查,每批培养基随机取不少于,5,支（瓶），培养,14,天，应无菌生长,二、培养基,（二）培养基的适用性检查,2.,灵敏度检查,灵敏度检查,方法：取每管装量为,12ml,的硫乙醇酸盐流体培养基,9,支，分别接种小于,100cfu,的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各,2,支，另,1,支不接种作为空白对照，培养,3,天；取每管装量为,9ml,的改良马丁培养基,5,支，分别接种小于,100cfu,的白色念珠菌、黑曲霉各,2,支，另,1,支不接种作为空白对照，培养,5,天。逐日观察结果。,结果判断：空白对照管无菌生长，加菌培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定,二、培养基,（二）培养基的适用性检查,适用性检查的菌种：,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,枯草芽孢杆菌,生孢梭菌,白色念珠菌,黑曲霉,图片取自青岛海博生物技术有限公司,三、方法验证试验,建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证,证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查,排除供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用,避免假阴性结果,方法,：薄膜,过滤,法、直接,接种法,四、无菌检查法,（一）检验数量及检验量,中国药典,现行版附录,批出厂产品最小检验数量表,液体制剂最小检验量及上市抽验样品的最少检验数量表,固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量表,四、无菌检查法,（二）对照试验,1.,阳性对照,必须长菌，用以证明微生物确实可在应用的试验条件下生长,根据供试品特性选择阳性对照菌,无抑菌作用和抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌,抗革兰阴性菌为主的供试品，以大肠埃希菌为对照菌,抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌,抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌,阳性对照管培养,48,72,小时应生长良好,四、无菌检查法,（二）对照试验,2.,阴性对照,不得长菌，用以检查试验过程中使用的溶剂、稀释液、冲洗液等对微生物生长及存活无影响,四、无菌检查法,（三）检查方法,1.,薄膜过滤法,通过滤膜过滤，将供试品中可能存在的微生物富集于滤膜上，再冲洗掉滤膜上的抑菌成分后，在薄膜过滤器滤筒内加入培养基，在所需温度下培养，观察是否有菌生长,四、无菌检查法,（三）检查方法,2.,直接接种法,3.,培养及观察,将含培养基的容器在规定的温度培养,14,天，逐日观察并记录是否有菌生长。必要时可转种及涂片,五、无菌检查结果判断,（三）检查方法,1.,阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。,2.,若供试品管显澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。,3.,若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。,4.,试验若经确认无效，需依法重试。,第,二,节,微生物限度检查,微生物限度检查法,系检查,非规定灭菌制剂,及其原料、辅料受到微生物污染程度的方法，检查项目包括,细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查,。,微生物限度检查成为,非规定灭菌制剂,保证药品质量的重要检查内容，也是综合评价药品生产各环节卫生状况的一个依据。,一、常规技术要求及检验量,（一）技术要求,1.,检查应在环境洁净度,10000,级下的局部洁净度,100,级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。,2.,单向流空气区域、工作台面及环境应定期按,医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法,的现行国家标准进行洁净度验证。,3.,供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。,4.,细菌培养温度为,30,35,；霉菌、酵母菌培养温度为,23,28,；控制菌培养温度为,35,37,。,5.,检验结果以,1g,、,1ml,、,10g,、,10ml,或,10cm,2,为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。,一、常规技术要求及检验量,（二）检验量,一次试验所用的供试品量,(g,、,ml,或,cm,2,),。除另有规定外，一般供试品的检验量为,10g,或,10ml,；膜剂为,100cm,2,；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加,20g,或,20ml,。,检验时，应从,2,个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于,4,片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的,3,倍量供试品。,二、样品供试液的制备,中国药典,现行版附录中提供了液体供试品、固体、半固体或黏稠性供试品以及需用特殊方法制备供试液的供试品的供试液制备方法。,需用特殊方法制备供试液的供试品有：非水溶性供试品、膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂、喷雾剂供试品及具抑菌活性的供试品。,三、菌种及培养基,（一）菌种,1.,细菌、霉菌、酵母菌计数检查的对照试验菌种,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、,白色念珠菌,、,黑曲霉,2.,控制菌检查的对照菌种,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌,三、菌种及培养基,（二）培养基,1.,细菌、霉菌及酵母菌计数,检查常用的培养基,营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、,改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、,酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。,2.,控制菌检查,常用的培养基,用于菌液制备的营养琼脂培养基等常规培养基,胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基等,20,余种用于培养基适用性检查、方法验证试验及供试品检查的培养基。,三、菌种及培养基,白色念珠菌,玫瑰红钠琼脂培养基,大肠埃希菌,曙红亚甲蓝琼脂培养基,四、方法的验证试验,建立微生物限度检查法时，应先进行方法验证：,确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌的菌落计数测定或控制菌的检查。,选择法定试验菌按照规定的方法及要求进行。,五、药品的微生物限度检验方法,（一）细菌、霉菌及酵母菌计数,检测的是药物在单位质量或体积内所存在的活菌数量,评价生产过程中原辅料、设备、器具、工艺、环境及操作者的卫生状况,五、药品的微生物限度检验方法,（一）细菌、霉菌及酵母菌计数,1.,计数方法的验证,用以保证方法中供试液没有抗菌活性、培养条件适宜细菌、霉菌及酵母菌生长、制备过程中稀释剂未受微生物干扰、供试液稀释级选择适宜。,验证试验包括试验组、菌液组、供试品对照组及稀释剂对照组,判断指标,:,各试验菌每次试验的菌数回收率,五、药品的微生物限度检验方法,（一）细菌、霉菌及酵母菌计数,2.,供试品检查方法,（,1,）平皿法,根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液,1ml,，置直径,90mm,的无菌平皿中，注入,15,20ml,温度不超过,45,的溶化的,营养琼脂培养基（细菌）,或,玫瑰红钠琼脂培养基,（霉菌）或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（酵母菌），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备,2,个平板。平皿法以培养后细菌、霉菌或酵母菌在琼脂平板上形成的独立可见的菌落为计数依据，按照菌数报告规则进行报告。,同时取试验用的稀释液,1ml,，同法操作，作为阴性对照试验。每种计数用的培养基各制备,2,个平板，均不得有菌生长。,营养琼脂培养基,取相应稀释级的供试液,1ml,置无菌平皿中,玫瑰红钠琼脂培养基,阴性对照试验,细菌、霉菌计数,试验用的稀释液,1ml,细菌、霉菌计数,图片截取自原中国药品生物制品检定所,无菌检查和微生物检查操作规范,视频,五、药品的微生物限度检验方法,（一）细菌、霉菌及酵母菌计数,2.,供试品检查方法,（,2,）薄膜过滤法,所用滤膜孔径不大于，直径一般为,50mm,。,取相当于每张滤膜含,1g,、,1ml,或,10 cm,2,供试品的供试液（或适宜稀释级的供试液,1ml,），加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。用无菌冲洗液冲洗滤膜后，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养，培养条件和计数方法同平皿法。每种培养基至少制备一张滤膜。根据菌数报告规定计数，如超过规定限量即可认定不合格。,同时取试验用的稀释液,1ml,同法操作，作为阴性对照，阴性对照不得有菌生长。,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,检查非规定灭菌制剂中是否存在有可疑的致病菌,控制菌检查项目包括大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌。,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,1.,适用性检查,适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查,促生长能力检查用以保证在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间内，试验菌生长良好（液体培养基）、菌落大小、形态特征与对照菌一致（固体培养基）,抑制能力检查用以保证其他试验菌无法生长,指示能力检查用以保证培养基上试验菌的生长情况（液体培养基）、菌落大小、形态特征（固体培养基）、指示剂反应情况等与对照培养基一致,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,2.,方法验证试验,控制菌检查方法的验证试验,用以保证方法中供试液没有抗菌活性、所采用方法适合于该产品的控制菌检查,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,3.,阳性对照试验和阴性对照试验,试验菌的阳性对照试验：应检出相应的控制菌,稀释液的阴性对照试验：应无菌生长,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,4.,控制菌检查法,（,1,）大肠埃希菌,检查法：取供试液在胆盐乳糖培养基的培养物，接种至含,5ml 4-,甲基伞形酮葡糖苷酸（,MUG,）培养基的试管内，培养，于,5,小时、,24,小时在,366nm,紫外线下观察，同时用未接种的,MUG,培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为,MUG,阳性；不呈现荧光，为,MUG,阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为,MUG,阴性和靛基质阴性。,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,4.,控制菌检查法,（,2,）大肠菌群,在乳糖胆盐发酵培养基管中，分别加入,110,、,1,100,、,1,1000,的供试液,1ml,，用稀释剂,1ml,作为阴性对照，均培养,18,24,小时，观察结果,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,4.,控制菌检查法,（,3,）沙门菌,检查法：取供试液在营养肉汤培养基中的培养物,1ml,，接种于,10ml,四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养,18,24,小时后，划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基平板上，根据培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，判断是否检出沙门菌。如菌落形态特征相符或疑似，还应通过用三糖铁琼脂培养基高层斜面进行斜面和高层穿刺接种试验做进一步判断。,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,4.,控制菌检查法,（,4,）铜绿假单胞菌,检查法：取供试液在胆盐乳糖培养基的培养液，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，根据培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，判断是否检出铜绿假单胞菌。如菌落形态特征相符或疑似，还应通过氧化酶试验及绿脓菌素试验做进一步判断,五、药品的微生物限度检验方法,（二）控制菌检查,4.,控制菌检查法,（,5,）金黄色葡萄球菌,检查法：取供试液在亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基的培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上。根据培养后平板上有无菌落生长、或生长的菌落形态特征，判断是否检出金黄色葡萄球菌。如菌落形态特征相符或疑似，还应通过血浆凝固酶试验做进一步判断,第,三,节,抗生素效价的微生物检定法,抗生素微生物检定法,在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。,中国药典,现行版：管碟法和浊度法,一、检定原理,标准品溶液和供试品溶液,量反应平行线原理：在相同试验条件下，标准品溶液和供试品溶液对试验菌所得的量反应曲线，在一定剂量范围内互相平行,检定方法,管碟法：二剂量法、三剂量法,浊度法：二剂量法、三剂量法、标准曲线法,二、试验菌,管碟法试验菌：,枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌、啤酒酵母菌、肺炎克雷伯菌、支气管炎伯德特菌。,浊度法试验菌：,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌,三、管碟法,利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,国际上抗生素药品检定的经典方法。,中国药典,法定方法：二剂量法和三剂量法,三、管碟法,四、浊度法,利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。,中国药典,现行版法定方法：标准曲线法、二剂量法和三剂量法。,第,四,节,生化药物效价的生物测定法,生化药品,采用生物化学方法，从生物材料中分离、纯化、精制而成的用以治疗、预防和诊断疾病的药品如氨基酸、肽、蛋白质、酶类,剂量以效价（单位）表示,中国药典,现行版正文下列入,【,效价测定,】,多采用生物检定技术测定效价,名 称,效价检定指标,标准品,检定用生物体,升压素,血压升高的程度,垂体后叶标准品,成年雄性大鼠,肝素,延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝固时间的作用,肝素标准品,新鲜兔血或兔、猪血浆,绒促性素,对幼小鼠子宫增重作用,绒促性素标准品,雌性幼小鼠的子宫,缩宫素,引起离体大鼠子宫收缩的作用,垂体后叶或合成缩宫素标准品,成年雌性大鼠的子宫,胰岛素,引起小鼠血糖下降的作用,胰岛素标准品,成年小鼠 血,精蛋白锌胰岛素注射液,降低家兔血糖的作用,胰岛素标准品,健康家兔 血,名 称,效价检定指标,标准品,检定用生物体,硫酸鱼精蛋白,延长新鲜兔血或猪、兔血浆凝结时间的程度,肝素标准品,新鲜兔血或兔、猪血浆,卵泡刺激素,对幼大鼠卵巢增重的作用,尿促性素标准品,雌性幼大鼠卵巢,黄体生成素,对幼大鼠精囊增重的作用,尿促性素标准品,雄性幼大鼠精囊,降钙素,对大鼠血钙降低的影响,降钙素标准品,大鼠 血,生长激素,使幼龄去垂体大鼠体重和胫骨骨骺板宽度增加的程度,生长激素标准品,幼龄去垂体大鼠,第,五,节,药品的安全性检查,一、异常毒性检查,给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法,中国药典,现行版以小鼠在给药后,48,小时内不得有死亡为异常毒性检查合格,常规给药途径包括静脉注射、腹腔注射、皮下注射和口服给药。,二、热原检查,将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定的方法。,热原系指药品中含有的能引起体温升高的杂质，目前多认为是指细菌内毒素的脂多糖。,三、细菌内毒素检查,利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法,细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁的构成成分，可激活中性粒细胞，造成内源性热原质释放，作用于体温调节中枢引起机体发热。,内毒素是药品热原检查不合格的主要原因,中国药典,现行版中细菌内毒素检查方法包括凝胶法和光度测定法,四、升压及降压物质检查,升压物质检查法,比较垂体后叶标准品与供试品升高大鼠血压的程度，以判定供试品中所含升压物质的限度是否符合规定的方法。,降压物质检查法,比较组胺对照品与供试品引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定的方法。,五、过敏反应检查,将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。,