第五章 转基因动物与生物反应器OK

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章,转基因动物与生物反应器,将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；,接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；,移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转,入的外源基因；,利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。,将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称为,转基因动物（transgenetic animal）。,外源目的基因的制备,外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞,选择获得携有目的基因的细胞,选择合适的体外培养系统和宿主动物,转基因细胞胚胎发育及鉴定,筛选所得的转基因动物品系,第一节 目的基因的制备,一、目的基因的来源,采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；,通过,mRNA,合成,cDNA,；,人工合成的,DNA,片段；,聚合酶链式反应（,PCR,）扩增特定基因片段。,二、目的基因的克隆,通过载体在适当的宿主中克隆,选择载体,目的基因与载体的连接,重组体导入受体细胞,通过,PCR,反应克隆目的基因,三、目的基因的转移,电穿孔法,显微注射法,裸露,DNA,直接注射,磷酸钙,DNA,共沉淀法,脂质载体包埋法,病毒介导的生物学方法,电穿孔法实现外源基因的转移,利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。,此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。,显微注射转基因技术,利用显微操作技术转移外源基因的方法。,此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。,磷酸钙DNA共沉淀法基因转移技术,这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。,但转移效率较低，仅有1%5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可以在细胞中稳定表达。,脂质载体包埋法,将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。,这种方法转基因效率高。,病毒介导的生物学方法,第二节 转基因动物的方法,反转录病毒法,基因显微注射法,胚胎干细胞移植法,一、基因的显微注射法,何为显微注射？,显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。,通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，,48,小时后再注,射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下,5-10,个，超,数排卵为,35,个；,与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵；,将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内 ；,将,25-40,个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ；,受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ；,从小鼠子代体内取出,DNA,样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位,点 ；,子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达 。,DNA显微注射法的基本程序,通过DNA显微注射获得转基因小鼠示图,（一）显微注射DNA的制备与纯化,DNA,构型和末端结构,载体,DNA,的长度与浓度,溶解,DNA,的缓冲液,DNA,的纯度,（二）鼠的准备与要求,转基因鼠实验所用各类鼠,（三）超排卵与取卵,孕马血清（,PMS,）其有效成分为卵泡刺激素（,FSH,）。,人绒毛膜促性腺激素（,hGG,）,雌鼠的排卵时间：,雄鼠的排精时间：,受精一般发生在：,1 超排卵,制定排卵程序：,(1) 于第一日中午先向小鼠腹腔内注入5一l 0单位的PMS；,(2) 过48小时(第三天中午)腹腔内注入510单位的人hCG(注射后1113 小时,后排卵)；,(3) 令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再,重用，但成功率下降；,(4) 检查阴栓(第四日晨)；检查阴栓可判定是否受精；如已受精则出现阴栓。,2 受精卵的收集,(1)检查阴栓：有白色阴栓的小鼠可用，引颈处死动物：,(2)取输卵管：剖开腹腔，取出输卵管，置入含有3ml培养液的60mm直径的瓶皿中；,(3)取卵子；在20或50解剖镜下找到输卵管，在卵管膨大的壶腹部(于卵管开口近,处)隐约可见内含的胚卵，把胚卵团用尖摄轻轻压挤出，用吸管移入含有400,l,分离,液的表玻皿中；,(4)另准备45个瓶皿，每皿内均充有胚胎培养基400,l,并覆盖有厚8mm硅烷油或液,体石蜡层(Fisher产，研究用)，硅烷油和石蜡巳预先在5%CO,2,中置371时做平衡,处理，覆硅烷油或石蜡层的目的是为防止培养液蒸发、散热和pH改变；,(5)向含卵团表玻皿的分离液中加5,l,新制备的透明质酸酶(透明质酸酶10mg1ml分,离液，Sigma产)，把胚卵团消化分散开；,(6)当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管转移入培养皿中，通过硅油层接,种入任一培养液小滴中)，以清除酶的继续作用；,(7)再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶和摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口)，,此时的卵己可用作DNA注射之用。,（四） DNA显微注射,制备持卵管与注射针,持卵管制备：,在火焰灯上将微玻璃管拉成中间较细的约,510cm,长的一段，其口径约,80120,m,，用玻璃刀将其在离颈部,2,cm,处切断，再把切口烧成如图形状，口径约,15,m,。将尖部移近火焰喷灯略加热，用镊子轻触尖部适宜位置，使变成如图所示角度。,注射针的制备：,由拉针器制成，针的口径应低于,1 m,。,（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡,（厚约5mm）；,（2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100,l,为单元的小滴,数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)；,（3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中；,（4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，,重悬于注射缓冲液中(含1mgDNAml)，使其最终浓度为：；,（5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消,除末溶解物，防止阻塞注射管口；,（6）把待注射用的DNA装入注射管中；,2 DNA注射,（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养,液， 仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继,之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；,（8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵,细胞膜内(小鼠胚卵直径约10,m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原,核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注,射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射；,注射细胞数量越多越好；,（9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待,注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种；,（10）镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。,（五）体内接种,（1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用；,（2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培养液，,排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)； 最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别；,（3） 麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)；,（4） 剪出背肾部两侧毛，碘酒酒精消毒；,（5） 使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm；,（6） 轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见,成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚,卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入,输卵管内；,（7） 把输卵管及周围组织送回腹腔内；,（8） 仔细紧密缝合创口，,（9） 再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。,（六）显微注射法获得转基因鼠的成活率,优点：,转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何,病毒基因组片段，绝对安全 。,缺点：,整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不,表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺,失等；需显微操作仪，技术性要求强。,二、胚胎干细胞方法,胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）,是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。,它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。,可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。,（一）ES细胞的建立与维持,动物的准备：,取受精之后天的母鼠分离鼠胚。,胚胎的分离和初培养：,天孕鼠 鼠断颈处死 解剖小鼠取出胚胎,体外培养胚胎 46天后，离散ICM。,ICM的离散与ES的分离：,分离ICM 酶解细胞团 培养离散细胞 ES细胞集落,ES细胞的扩增：,离散ES细胞 置四孔培养板中培养,ES细胞的常规培养：,ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养,（二）ES细胞的基因组操作,将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。,这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。,与整合位点两端区域同源的两段,DNA,序列（,HB1,和,HB2,）,转入的目的基因（,TG,）,编码抗,G418,的新霉素磷酸转移酶基因（,neo,r,）,两个不的胸苷激酶基因（,HSV-,tk,1,和,HSV-,tk,2,）,（三）转基因ES细胞的筛选,正负选择法,正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：,通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。,负选择法筛选出特异整合型ES细胞：,如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能与TG和neo,r,一起整合，这时用GCV筛选， tk基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是负选反择。,（四）转基因ES细胞的检测,（五）转基因小鼠的繁育,正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后就可以移入胚泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。,（六）获得纯合的转基因鼠,优点：,基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。,缺点：,需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产,仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件,需要大量资金投入的事情。,三、反转录病毒法,（一）反转录病毒感染法的原理,反转录病毒单链,RNA,分子；,病毒进入细胞后，,RNA,编码出反转录酶；,病毒,RNA,反转录为双链分子；,DNA,整合到宿主细胞,DNA,中。,（二）反转录病毒感染法的载体的构建,提取病毒未整合的环状形式,DNA,；,将环状,DNA,克隆到适当的载体中；,选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；,将外源目的基因克隆到载体中,（三）通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞,反转录病毒载体的工作原理：,寄生在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。,四、重组反转录病毒感染早期胚胎,优点：,能有效地将转基因整合入受体细胞的基因组内，单拷贝整合型；转,基因整合后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在TR区域内进,行，不会破坏转基因结构,缺点：,载量较小，一般只有8kb，可能会因缺少必须的调控元件而影响转,基因表达；尽管病毒载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细胞的,包装过程中，若与整合型辅助表达基因组发生同源重组，就有可能,组装成野生型逆转录病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因,动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。,第三节 转基因动物的检测,DNA,的提取,斑点杂交和,PCR,扩增,Southern,杂交,Northern,杂交,表达产的检测,第四节 转基因动物研究现状,一、转基因牛,从屠宰场杀掉的奶牛体内收集,卵母细胞，并使之在体外成熟,用公牛精液对成熟卵母细胞进,行体外受精；,受精卵离心，浓缩卵黄；,将欲导入的DNA微注射到桔前,核当中；,对胚胎进行体外培养；,利用非外科移植术将一个胚胎,植入发情的代孕母牛子宫内；,对于代进行州A检测，确定是,否存在转人基因。,二、转基因绵羊、山羊和猪,在山羊奶中生产ATT,三、转基因禽类,四、转基因鱼,第五节 转基因动物的应用,一、转基因动物在生命科学基础研究中的应用,研究基因的结构与功能,研究基因的组织特异性表达,研究发育相关基因的表达与调控,克隆在发育中起重要作用的基因,基因多级调节系统的研究,细胞功能研究,基因敲除（gene knock out）,，是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分观察整体推测功能的三部曲思想相似。,基因敲除的技术路线如下：,（1）构建重组基因载体（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内（3）用选择培养基筛选已击中的细胞（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。,二、转基因动物在医药研究领域中的应用,研究病毒性疾病,研究建立人类疾病的转基因动物模型,转基因动物与基因治疗,生产天然活性药物蛋白,第六节 转基因动物研究存在的问题,转基因动物的低效性,转入基因造成宿主基因突变问题,转入基因的表达问题,病毒转基因研究存在的问题,转基因动物模型与预期不符问题,乳腺生物反应器的问题,社会问题,第七节 动物生物反应器,一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor）,，几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，,生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。,其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。,一,、,动物血液生物反应器,外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。,大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。,二、动物膀胱生物反应器,外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。,膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。,三、动物乳腺生物反应器,动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物, 指导外源基因在乳腺中表达, 并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。,1. 动物乳腺生物反应器的制备,（1）表达载体的构建,目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BL G)，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。,（2）目的基因的选择,选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。,（3）体外重组,选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。,（4）基因转导,将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。,（5）胚胎移植,利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁,来获得目的基因表达产物。,（6）鉴定,转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。,2. 动物乳腺生物反应器的优点,产品质量稳定,产品成本低,研制开发周期短,无污染,经济效益显著,在山羊奶中生产ATT,3. 动物乳腺生物反应器的应用,高乳汁营养价值,生产药用蛋白,4. 动物乳腺生物反应器存在的问题,（1）外源基因在动物体内的位点整合问题,（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题,（3）目的蛋白的翻译后修饰问题,（4）转基因表达产物的分离和纯化问题,（5）转基因的技术与方法问题,（6）伦理道德问题,