实验五、叶绿体的分离及离体叶绿体的还原活性

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二,叶绿体的分离及离体叶绿体的还原活性,一、实验目的,学习制备具有活性的离体叶绿体和测定离体叶绿体还原活性的方法。,通过学习分离制备叶绿体的技术方法，加深对希尔反应的理解及对光反应的认识。,1,、叶绿体的分离,:,采用,离心,分级分离。,即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞碎片，后用高速离心沉降叶绿体。,二、实验原理,2,、,希尔反应（,Hill reaction,）,离体的完整叶绿体，在合适的氧化剂（,2.6-,二氯吲哚叮酚 ，一种,蓝色染料,） 存在下，当被照光时，可以使水光解释放氧气，接受电子和,H,+,后被还原成,无色,。,实验中可以直接观察,颜色的变化,，也可用分光光度计对还原量进行精确测定，该变化在,45min,内呈线性关系,。,光,叶绿体,2H,2,O +2A 2AH,2,+O,2,三、实验材料,菠菜叶片,四、设备与试剂,分光光度计，离心机，照光装置，试管，移液管，烧杯，纱布，研钵等。,NaCl,、,Tris,缓冲液、,2.6-,二氯吲哚叮酚,五、实验步骤,1.,提取叶绿体：,称鲜菠菜叶,5g,，加,10 ml 0.35M,NaCl,、,1ml,Tris,缓冲液、石英砂，研磨。,匀浆用脱脂棉过滤。,1,2,3,4,5,用天平将各组滤液调平。,1000,转,/,分离心,5,分钟，取上清液；,3000,转,/,分离心,5,分钟，去除上清液，保留沉淀。,在沉淀中加入,5ml,NaCl,，搅匀，得到叶绿体悬浮液。,2.,希尔反应测定,管号,0.1MTris,缓冲液,叶绿体,煮沸,2.6-,二氯吲哚叮酚,1,9.3ml,0.2ml,0.5ml,2,9.3ml,0.2ml,5min,0.5ml,3,9.8ml,0.2ml,将三支试管中的溶液倒入对应的比色杯中，以,3,号试管调零，,620nm,处比色。,将比色杯置于光源,60cm,处照光。,每隔,1,分钟快速读下光密度的变化，连续进行,56,次读数。,六、实验结果,一,二,三,四,五,1,2,请对结果作出解释,A,时间（,min,）,1,2,3,七、注意事项,2.6-,二氯吲哚叮酚 必须在煮沸加热后滴加。,溶液加入比色杯就开始计时。,每次测光时都应调零和百分比。,八、思考题,1.,试管中蓝色褪去的原因是什么,?,与光照有什么关系,?2,煮沸对叶绿体有何影响？,