细胞培养必备设施常用器材和培养基

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,第,3,章 细胞培养的必备设施、常用器材和培养基,主要内容,:,细胞培养的必备设施,细胞培养常用器材及处理方法,常用溶液、培养液及其配制,第一节 细胞培养的必备设施,一、无菌实验室,防止微生物污染和有害因素的影响,工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。,二、超净台,三、恒温培养箱,恒温培养箱,CO,2,培养箱,四、其他设备,倒置显微镜,电热鼓风干燥箱,电子天平,恒温水浴箱,离心机,压力蒸汽消毒器,冰箱,第二节 细胞培养常用器材及处理方法,一、玻璃器材,培养皿,滴流瓶,刻读吸管、离心管等,培养瓶,烧杯、量筒等,三角烧瓶,玻璃器材的消毒处理方法,清洁液浸泡，自来水冲,10,次，单蒸水洗,2,次，培养瓶再用三蒸水浸泡过夜，烘干，包装，灭菌,二、塑料器材,多孔培养板,培养皿,培养瓶,塑料器材的消毒处理方法,用,3%HCl,或,2%NaOH,溶液浸泡过夜（单用或交叉处理）-水洗,10,次-单蒸水,2,次-三蒸水浸泡过夜-烘干-紫外线或辐射灭菌,三、橡皮器材,橡皮制品,(,最好是硅制品,),主要是各种瓶或试管的塞子、盖子。,橡皮器材的消毒处理方法,5%NaOH,煮-水洗-,4%,盐酸煮-水洗,810,次􀃆-单蒸水洗三次、二蒸水洗一次。,四、金属器材,剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等,金属器材的消毒处理方法,纸擦去表面的油脂-洗衣粉煮沸，或用,1%,碳酸氢钠煮沸,15,分钟-水洗-,95%,酒精纱布擦干-包装灭菌,五、其他物品,纱布,注射器和针头,第三节 常用溶液、培养液及其配制,一、平衡盐溶液,细胞培养中常用的基本液体。,（一）配液时的注意事项,1）称量要准确,2）物质的纯度,3）物质的可溶性,4）物质的不稳定性,5）贮存液,（二)几种常用溶液的配制方法,1、无钙、镁离子溶液,2、磷酸盐缓冲液,3、Hanks液,1、无钙、镁离子溶液(1000ml),氯化钠(NaCl) 8g,磷酸二氢钠,氯化钾(KCl) 0.2g,碳酸氢钠 1g,柠檬酸三钠,葡萄糖1g,加去离子水或双蒸水至1000mL,2、磷酸盐缓冲液,甲液：磷酸氢二钠溶液,磷酸氢二钠(无水) 28.4g 氯化钠加去离子水或双蒸水至1000mL,乙液：0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液,磷酸二氢钠(无水) 2.4g 氯化钠加去离子水或双蒸水至1000mL,甲、乙液于4保存，使用时按比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。,3、Hanks液,(1)母液甲(20x)配法, ) 160g，) 8g，,2,O（A.R) 2g，,2,O(A.R) 2g，依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。,CaCl,2,溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌（此液应单配，单溶）。,待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4保存。,(2)母液乙(20)配法, Na,2,HPO,4,.12H,2,，KH,2,PO,4,，葡萄糖溶于800ml双蒸水中。,0.4%酚红液酚红放在玻璃研钵后加0.01N NaOH，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为，4保存。,待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至,1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40保存,(3)使用液（1）配法,取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)，置室温后4保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO,3,调至所需pH。,二、其他溶液,（一）pH调节液,（二）消化液,（三）抗生素溶液,（四）0.5%台盼兰(Trypan blue)液,（五）0.1%结晶紫,三、培养基（维持液、营养液）,(,一,),天然培养基,(,组成,=,平衡盐溶液,+,天然动物成分,),1,、,血清,（马、兔、鸡、小牛、新生小牛和胎牛）,（,1,）收集与保存,（2）小牛血清对细胞的作用,提供细胞增殖所必须的生长因子（A因子促进；B、C因子对细胞有抑制生长作用；D因子促进细胞粘连）,对细胞附壁有利,保护作用，解除毒性物质对细胞的毒性作用；免受冻存，搅拌，损伤,其他：利于染色体分布,（3）影响血清作用的因素,年龄；血型（ABA或O）；血色素；胆红质；脂肪酸；红细胞生成素；肿瘤患者血清；浓度；支原体污染,2、水解乳蛋白(hydrolytic albumin),乳蛋白经蛋白酶和肽酶混合物水解而得的制品，常用浓度为0.2%0.5%，用平衡盐溶液配制。0.4%浓度的水解乳蛋白经分解后几乎与人血浆中氨基酸成分相当。,3、酵母浸出液：它还含有丰富的维生素，增加细胞的生长率特别有利。常用浓度为0.1%。,4、鸡胚浸出液（加过程）,5、鸡血浆,6、胰酶消化牛心肌浸液,(二)人工合成培养基（加配制）,1、种类：199，Eagle 、RPMI1640、HAMF12、NCT109等。,2、优点：,已知成分配制，培养条件一致,有利于定量研究代谢成分,可延长培养时间，节省人力、物力,无潜在病毒污染,便于细胞大量生产,人工合成培养基的成分,3、人工合成培养基的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些辅助物质。,