等电聚焦电泳.

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,等电聚焦电泳,背景介绍,等电聚焦电泳技术（isoelectric focusing，IEF）是1980年慕尼黑工业大学食品科学和化学分析研究所的Radola B J发展起来，并经国外一些种子检验实验室改进的一种非常实用的电泳技术，广泛应用于生物学的各个领域。,该方法是利用蛋白质具有两性解离及等电点的特征，加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。主要特点是：灵敏度及分辨率高、重复性好，特别适用于大批量纯度检测和真实性鉴定以及遗传多样性等群体生物学领域的研究。,基本原理,等电聚焦电泳(IEF)是利用两性电解质载体形成一个连续而稳定的线性pH梯度，将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置 ，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。,如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度，则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的oH值的差别带上正电或负电。,载体两性电解质,pH,梯度,(carrier,ampholyte,pH gradient),等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立,pH,梯度。,固相,pH,梯度,(immobilized pH,gradients,IPG,),等电聚焦，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成,pH,梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的,pH,梯度，分辨率可达,。,载体两性电解质,/,固相,pH,梯度混合技术，即在固相,pH,梯度凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等电聚焦”。,固相,pH,梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成,pH,梯度,.,后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等电点而形成,pH,梯度。,IEF的分类,pH梯度的形成,等电聚焦也是在电场下进行的一种精密分离技术，但由于必须在电场的方向附加一个pH场，利用各溶质迁移到pH等于其等电点的位置时便停止在那里而被分离。故技术的关键是如何形成稳定的pH场以及减小对流、扩散、散热以及电渗的影响。对于制备型的分离设备，解决以上诸问题的难度更大。,多种建立pH梯度的方法：,在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。,利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度约50，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且不易稳定。,加入附加物质建立,pH,梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成,单位的,pH,梯度。如在硼酸盐溶液中加,05%,甘油和,03%,蔗糖，可以形成,pH,为,范围的梯度，可分离血红蛋白。,在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在电极间便会形成,pH,梯度。这些两性电解质大多是一些多胺基多羧酸化合物。为了防止对流对,pH,梯度的干扰，可以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。,利用固定化两性载体形成,pH,梯度。就是把具有缓冲能力的基团或化合物用共聚或接枝的方法固定在载体上形成两性载体。载体可以是聚丙烯酞胺凝胶或葡聚糖等。被固定的化合物可以是带羧基的酸或带叔胺基的碱。采用这种方法可以形成稳定的,pH,梯度。但成本太高。,固定化两性载体和两性缓冲液相结合。,利用离子交换剂建立,pH,梯度。,Sluyterma(1978),利用离子交换剂建立一个有,pH,梯度的柱进行等电聚焦，称为色谱聚集。,由外循环建立的,pH,梯度，,Rilbe(1978),在两电极室把溶液进行循环，以在电泳分离室中建立一个稳定的,pH,梯度，称为流动电解。,缓冲液更新的方法。在电泳过程中，溶液的离子会产生电迁移。在两个电极室中离子的消耗或积累，可由外部加和或取出加以平衡，以维持电泳池中缓冲液的组成和,pH,等流量泵不变。,流动电解,两性介质载体的选择,易溶于水，理想的两性电解质载体应在,pI,处有足够的缓冲能力及电导，前者保证,pH,梯度的稳定，后者允许一定的电流通过。,不同,pI,的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。,两性电解质的分子量要小，易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开，而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。,化学性能稳定，与被分离物质不起化学反应，也无变性作用。,pH,梯度制作利用的两性电解质是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的,pKa,和,pI,值。在外电场作用下，自然形成,pH,梯度。,电场下载体两性电解质的变化,在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷，只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等，净电荷为零。 引入电场时，载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动，最终在分子净电荷为零的位置停止迁移。,(1)靠近阳极端的载体两性电解质，电负性最强,具有较强的缓冲氢离子的能力，使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阴极顺延;,(2)靠近阴极端的载体两性电解质，电正性最强，具有较强的缓冲氢氧根离子的能力，使环境的pH等于载体两性电解质的pI，一直向阳极顺延。,pH梯度支持介质,常用的,pH梯度支持介质是,凝胶，主要有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶最为常用。,循环流动等电聚焦示意图,循环等电聚焦,这里表示了两个流程。一个是用虚线连接的,A,、,C,室抽出的液体经冷却后回到,A,、,C,室。消耗掉的电解质由,V,补充。另一个流程是从,A,室抽出的液体经冷却后回到,C,室，,V,0,。为了防止对流作用，腔室厚度不宜超过,5mm.,目前多采用,2mm,或更小。,等电聚焦电泳装置,分段固定化pH梯度装置示意图,2. 分段固定化pH梯度装置,A、B是固定化两性电解质段，C段为充满载体液段，用一泵把液体循环。最后杂质都收集到正、负极上，只余下等电点的蛋白质在循环。利用这个设备可以处理大量液体和分离大量的蛋白质，而且收率很高，存在的缺点是固定化两性电解质能够水解，使pH场破坏。,常用电泳仪,简单操作步骤,配胶：胶液组成为载体两性电解质，凝胶贮液，蒸馏水，混合样品，染色物质等。,灌胶：注意不要产生气泡。冷却,2h,后可接入电泳池。,加电极液,电泳,样品收集检测,等电聚焦电泳的优缺点,准确度和精确度较高，操作简单。,IEF,分离在较低的工作电压下,(20 V/cm),进行，可以避免蛋白质上专一结合（以共价键等强作用力结合，一定程度上依赖于蛋白质的构象,),的金属在电场作用下的丢失，这部分金属大多构成蛋白质的活性中心或结构中心，比非专一结合金属具有更重要的生物学意义。,在样品分离方面，载体两性电解质,pH,梯度的重现性仍然是难以解决的问题。选用固态,pH,梯度可以提高分辨率，加大上样量，受到样品中盐的干扰小，无边缘效应，并有很好的重现性，这对建立微量元素种态分布数据库这样的工作是必需的,分辨率高。等电聚焦电泳属于非变性蛋白质分离分析技术，其分辨率至少可达,0.01 pH,单位。,pH梯度不稳定现象,IEF实验技术不断进步的同时，却一直存在着pH值梯度不稳定的现象，即存在着pH梯度的阴极和阳极漂移现象。阴极漂移是指在IEF实验中pH梯度的碱性端逐渐消失的过程；反之，如果其酸性端逐渐消失则称为阳极漂移。,为了阐明IEF中pH值梯度不稳定的机制，出现了各种假说：,载体两性电解质向阴、阳极的等速电泳（ITP）迁移；,在阴极因CO,2,的吸附而引起阴极液组分和浓度的变化；,在pH梯度的中性区域生成一段纯水，水的IEF导致水在电泳管中的聚集并向两端反流；,不同等电点载体两性电解质的选择性缺陷而引起的不稳定；,两性电解质带电配体的进行性地结合或分离引起的不稳定；,载体两性电解质相互反应的存在而引起的不稳定性；,相对迁移的氢离子和氢氧根离子浓度的不平衡。,等电聚焦电泳的应用,IEF是一种简便、快速、高效的分离分析方法，特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类和抗体等的分离分析，能够满足组分定量、杂质检出、质量控制、临床诊断等方面的要求。目前等电聚焦电泳主要用于两性电解质样品等电点的测定,两性电解质样品的分析、分离和制备，在同功酶的鉴定及蛋白质的微量分析(1050g)上应用尤为广泛。随着生命科学的发展，特别是人类基因组计划(HGP)全面完成之后所谓“后基因组”时代的来临，对复杂生命体系的准确表征和分析就显得日益紧迫，其中蛋白质组研究是一个极其重要的部分。,谢 谢！,