第三章 免疫分析法

,生物药物分析,第三章 免疫分析法,一、,概述,二、,抗原,三、,抗体与免疫反应,四、,免疫分析方法及应用,主要内容,一、,概述,二、抗原,三、抗体与免疫反应,四、免疫分析方法及应用,主要内容,免疫学是研究,免疫系统的结构与功能,，了解其在免疫应答反应中对机体有益的防卫功能和有害的病理损伤的机制，研究有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学学科。,一、概述,什么叫免疫分析？,基于抗原和抗体的特异性反应,进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。,在体内发生的抗原抗体反应为,体液免疫应答,的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于,抗原或抗体的检测,，用于免疫学诊断。,(1),在实验药物动力学和临床药物学中,，测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；,(2),在药物的临床检测中,，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物血液浓度进行监测；,(3),在药物生产中,，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；,(4),对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。,在药物分析中，免疫分析法的应用主要集中在以下几方面：,免疫分析,：,利用抗原与抗体的特异性结合作用，来选择性识别和测定，可以作为抗体或抗原的待测物,.,免疫分析方法,非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化,）,标记免疫分析,标记物,有无,非放射免疫分析,放射免疫分析（放射污染）,酶联免疫分析,荧光免疫分析,电化学免疫分析,化学发光免疫分析,免疫分析,免疫分析检测的发展,放射免疫检测,（兴起于,20,世纪,70,年代,),酶联免疫检测,（兴起于,20,世纪,80,年代，各临床机构普遍使用）；,以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术,（,20,世纪,90,年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。,特点,可逆性,比例性,反应阶段性,特异性,免疫分析法的特点,特异性,特异性,：抗原与抗体结合反应的专一性,分子基础,:,抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性,可逆性,可逆性：,抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，,解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,影响因素：,抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离,环境因素对复合物的影响,pH,、离子强度,比例性和,反应阶段性,比例性：,抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系,前带,(prezone),：抗体过量,后带,(postzone),：抗原过量,等价带,(equivalence zone),：抗原抗体比例合适,一、概述,二、,抗原,三、抗体与免疫反应,四、免疫分析方法及应用,主要内容,2.1,定义,抗原（,antigen,）：,指在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。,免疫原性（,immunogenicity,）：被注射入动物体内后，使其,产生循环抗体或改变免疫细胞,的反应性,抗原特异性（,antigenic specificity,）：具有能,与特异抗体作用,的性质,全抗原（,complete antigen,）,半抗原（,hapten,）：只能与特异抗体作用，但不引起机体免疫应答的分子,2.2,药物分子的抗原性,1,、药物分子的免疫原性,大多数的药物分子通常都是半抗原；,一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物也是完全抗原。,2,、药物分子的抗原特异性,药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性可能会发生改变。,3,、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通常会,与蛋白质载体合成人工抗原,进行试验。,常用载体：牛血清白蛋白（,BSA,）、卵清白蛋白（,OA,）、破伤风类毒素（,TT,）、钥孔蛋白（,KLH,）等。,（,1,）半抗原和载体结合的化学反应,多肽类激素,：活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键；与蛋白质或多肽的游离羧基缩合形成肽键,甾体,：通过含游离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连,抗生素,：,-,内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合；氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接,（,2,）半抗原和载体的选择原则,半抗原,：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反应的微环境；合理利用分子类似物之间的交叉反应。,载体,：载体对监测系统的影响；载体效应在免疫过程中的影响。,（,3,）合成抗原的测定,定性测定方法,：光谱分析、热力学分析,定量测定方法,：相对含量测定；绝对含量测定。,一、概述,二、抗原,三、,抗体与免疫反应,四、免疫分析方法及应用,主要内容,免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析，,特点是,抗体成为分析试剂,。,1,、抗体的结构与功能,抗体,泛指与待测分子特异性结合的蛋白质分子,，包括免疫球蛋白（,immunoglobulin,）,受体（,receptor,）和其他结合蛋白质，主要是免疫球蛋白，常用的是,IgG,分子,.,免疫球蛋白的基本结构,IgG,分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，,轻链与重链是由二硫键连接形成,，分为氨基端（,N,端），羧基端（,C,端）。,抗体的基本结构,IgG,分子由,四条多肽链,构成，,以二硫键相连,，有三个功能区。,抗体在,Fab,区结合抗原分子，同时通过,hi,区的转动以适应不同距离的抗原决定簇。,与抗原结合后，,IgG,分子构象改变，暴露出,Fc,上的活性位点，从而表现出固定和激活补体以及粘结单核细胞等亲细胞反应的功能。,Fab,：抗原结合片段,Fc,：可结晶片段,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,巯基乙醇还原,胃蛋白酶（,pepsin,）水解片段,裂解部位，铰链区,H,链间二硫键（,C,端）,裂解片段，,F,（,ab,）,2,，无,Fc,片段,与抗原结合可发生凝集反应,木瓜蛋白酶（,papain,）水解片段,裂解部位，铰链区,H,链间二硫键（,N,端）,裂解片段，,2,个,Fab,（,54KD,），一个,Fc,（,50KD,）,Fab,与抗原结合，不发生凝集反应。,2,抗体作为分析试剂的评价,抗体的特异性,是无与伦比的，不需或只需要简单的预处理。有,较高的稳定性,。,这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专一的基础。,此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗体分子有两个抗原的结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信号反差。,3,、抗体的制备,（,1,）常规抗血清（,多克隆抗体,）：指人工被动免疫后制成的多克隆抗体，是免疫分析中的重要工具。,免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清的分析鉴定。,免疫原的制备,免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。,水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的免疫原。,弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达到油包水的程度。,不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。,动物免疫,通常的免疫动物为家兔和羊。,免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。,免疫抗原量通常为,110mg,或,50100mg,。,试血及效价测定,家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量,0.5ml,。,不同稀释度的抗血清和,1%,的血细胞悬液按,1:1,混合，,37,保温,2h,后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免疫血清的效价。,（,2,）单克隆抗体,单克隆抗体,是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。所获得的抗体具有均一的特异性。,高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的,B,细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞,细胞培养法,&,接种动物体内生产法,制备步骤,2,、抗体的纯化,利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。,利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专一性的抗体。,3,、特异性抗体的筛选与效价测定,抗体的效价,又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需要的量。,免疫分析中，免疫血清中抗体的效价指将血清稀释，测定与一定的抗原能发生反应的最大稀释度，此最大稀释度即为血清的效价。,常用的效价测定方法有免疫扩散法、间接血凝法和,ELISA,法等。,一、概述,二、抗原,三、抗体与免疫反应,四、,免疫分析方法及应用,主要内容,四、免疫分析方法及其应用,放射免疫分析法（,R,IA,）,荧光免疫分析法（,F,IA,）,克隆酶给予体免疫分析法（,CED,IA,）,酶联免疫吸附分析法（,EL,ISA,）,放射免疫分析法（,radioimmunoassay,RIA,）,1968,年,Miles,和,Hales,建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。,由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法更加完善。,放射免疫分析（,radioimmunoassay,，,RIA,）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类,竞争性体外放射分析技术,.,基本原理,基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合,这种竞争可用以下反应式来表示：,抗原,抗体,常用的标记物：,125,I,和氚标记物,放射性活度（贝克，,Bp,）,1Bp,：每秒一次核衰变,比活度（,Bp/g,）：,每单位质量所含的放射性比活度,游离状态,结合状态,具体步骤,抗原抗体反应,结合的和游离的,放射性物质的分离,放射性活度的测定,柱色谱法,吸附法,沉淀法,抗抗体发,微孔滤膜法,固相法,求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）,荧光免疫分析法（,Fluorescence immunoassay,FIA,）,免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和,敏感性与显微示踪的精确性相结合的一项技术,以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原,荧光免疫分析法（,Fluorescence immunoassay,FIA,）,在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位,在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术,根据实验方法分类,直接法,间接法,补体法,其他,直接法,将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗,-,干燥,-,封片,-,镜检,操作简便、特异性高、非特异性染色少,敏感性低,抗原,标记抗体,荧光,间接法,先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原,-,抗体,-,抗体复合物，水洗,-,干燥,-,封镜,-,镜检,未知抗原,未标记抗体,标记抗体,荧光,补体法,利用补体反应，通过形成抗原,-,抗体,-,补体复合物发射荧光,补体,标记抗补体抗体,时间分辨荧光免疫测定,利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。,基本原理,它采用抗原与抗体的特异反应将,待测物与酶连接,，然后通过,酶与底物产生颜色反应,，用于定量测定。,测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,在这种测定方法中有,3,种必要的试剂：, 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂,）, 酶标记的抗原或抗体（标记物,）, 酶作用的底物（显色剂,）,酶联免疫吸附分析法（,ELISA,）,双抗体夹心法，属于,非竞争结合测定,。,它是检测抗原最常用,ELISA,，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。,其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成,固相抗体,-,抗原,-,酶标抗体免疫复合物,。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量,(OD,值,),，即可确定待测抗原含量。,实验原理 双抗体夹心法,酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。,具有酶促反应，显示出生物放大作用。,在,ELISA,中，常用的酶为,辣根过氧化物酶,(horseradish peroxidase, HRP),和碱性磷酸酶,(alkaline phosohatase, AP),。,1,、,HRP,催化过氧化物的氧化反应。,供氢体：邻苯二胺,(OPD),、四甲基联苯胺,(TMB),OPD,氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为,492nm,TMB,经,HRP,作用后共产物显蓝色，用,HCL,或,H2SO4,终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为,405nm,2,、,AP,为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯,(p-NPP),作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在,405nm,波长处有吸收峰。用,NaOH,终止酶反应,DNM-9602G,酶标分析仪,DNM-9602,标配酶标分析仪,DNM-9602A,酶标分析仪,酶标分析仪,思考题,1.,论述免疫分析法的定义，主要包括哪些方法？,2.,半抗原、全抗原、合成抗原、抗体、单克隆抗体的定义？,3.,什么是抗体的效价？,4.,常用的抗体包括哪两类？并比较它们的特性。,5.,论述放射免疫测定法（,RIA,）与酶联免疫分析法（,ELISA,）的基本原理与方法步骤,