金免疫技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/4,*,实验九 金免疫技术,2020/11/4,1,实验目的,了解胶体金和免疫金的制备方法,了解蛋白质最适标记量的确定,了解斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验原理,掌握金免疫测定技术,2020/11/4,2,胶体金的制备,免疫金的制备,斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验,尿HCG测定-斑点金免疫层析试验,实验内容,2020/11/4,3,金免疫技术：以胶体金作为标记物的免疫标记技术。,胶体金：指金微小粒子（1100nm）分散在溶液中所形成的金溶液。是,由金盐被还原成原金,后形成的,金颗粒悬液,。,用金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG）,胶体金具有高电子密度的特性，故金标蛋白抗原抗体结合处，显微镜下可见黑色颗粒；当这些标记物在标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点，以此用于抗原抗体物质的定位或定性。,2020/11/4,4,分类,一、金免疫组化染色技术,金（银）免疫光镜染色技术,金免疫电镜染色技术,二、金免疫测定技术,斑点金免疫渗滤试验,斑点金免疫层析试验,2020/11/4,5,第一节 胶体金与免疫金的制备,一、胶体金的特性及制备,1、结构：,胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuCl,2,-,），外层离子层（H,+,）则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。,形状：小的胶体金颗粒（1-30nm）呈球形，大的胶体金颗粒（30-100nm）呈椭圆形,胶粒的双电层结构示意图,2020/11/4,6,2、胶体金的一般性状,稳定性：稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。,对电解质的敏感性：打破胶体金的稳定，使分散的金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。,2020/11/4,7,影响胶体金溶液稳定性的因素,1、胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。,2、水化层的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。,3、胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。,2020/11/4,8,颜色和光吸收性：,通过改变柠檬酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒,胶体金粒径,1%柠檬酸钠加入量,胶体金特性,（nm),（ml)*,呈色,max(nm),16,2.00,橙色,518,24.5,1.50,橙红色,522,41,1.00,红色,525,71.5,0.70,紫色,535,四种粒径胶体金的制备及特性,2020/11/4,9,3、胶体金的制备方法,原理：向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。,常见的还原剂：,白磷,、乙醇、,枸橼酸钠、鞣酸,等,2020/11/4,10,方法：,所有容器要求干净，用酸或重铬酸钾洗液泡洗，用双蒸水冲洗干净。,配制氯化金溶液：取氯化金1克，溶于100ml双蒸水中，配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。,取上述氯化金溶液，稀释100倍，即成0.01%的氯化金溶液。,加热至沸腾，加适量柠檬酸三钠搅动，,加热至沸（约23min*），,冷却，加蒸馏水至原体积,* 见淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。,2020/11/4,11,4、胶体金的鉴定,主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描,max,来估计金颗粒的粒径。,肉眼、分光光度计、电镜等方法观察,应为清亮透明的液体,若胶体金混浊或液体表面有漂浮物，则制备的胶体金有较多的凝集颗粒,要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心。,2020/11/4,12,5、胶体金的保存,洁净的玻璃器皿中可较长时间保存；,少许防腐剂（如0.02NaN3）可有利于保存。,2020/11/4,13,胶 体 金1560 nm,优 质,劣 质,2020/11/4,14,6、制备胶体金的注意事项,（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。,（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，不应使用金属药匙称量氯金酸。,（3）制备胶体金应用双蒸/三蒸馏水，或者是 高质量的去离子水。,（4）玻璃容器必须是绝对清洁的，最好是经硅化处理的。,2020/11/4,15,二、免疫金的制备,免疫金：是指胶体金与抗原或抗体等的结合物，在免疫组织化学技术中，习惯上要称之为金探针。,制备方法：,1 胶体金溶液的pH值调整,2蛋白质最适标记量的确定,3标记过程,4离心去除未结合的蛋白质，反复洗涤24次,5免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存,2020/11/4,16,1 胶体金溶液的pH值调整,用,0.1mol/L K,2,CO,3,或0.1mol/L HCL调节PH至选定值，原则上选择待标记蛋白的等电点，也可略为偏碱，通常最适PH值需经过多次试验进行调整。,使用PH试纸进行调整，金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，所以不能用pH电极直接测定金溶液的pH值。应选用缓冲容量足够大的缓冲液(例如PEG20000液)稳定胶体金后再测定或保存。,2020/11/4,17,2蛋白质最适标记量的确定,将待标记蛋白作一系列稀释后各取一定量加入装有一定量胶体金的试管中，然后分别加入NaCl溶液，混匀后静置数小时，对照管(无蛋白)及加人蛋白量不足的管，溶液颜色由红变蓝；蛋白量足或超过的管保持红色不变，,其中含蛋白量最低的一管即为稳定胶体金所必须的最适标记量。以此比例并增加10%-20%即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量。,由于蛋白质溶液含盐量较高或形成聚合物极易影响标记过程，因此，标记之前最好将蛋白质溶液用低浓度的盐水透析数小时并高速离心除去聚合物。,2020/11/4,18,3标记过程,调节金溶胶至所需pH(用0.1mol/LK,2,CO,3,或0.1mol/LHCl),缓缓加入适量的待标记的蛋白质溶液，搅拌；,10分钟后，加入一定量的稳定剂，以防止抗体蛋白和胶体金的聚合和发生沉淀。常用5%BSA ，使其终浓度为1%，或加入1%聚乙二醇至标记总量的10%；,离心分离3060min(胶体颗粒不同则离心条件不同),沉淀悬浮于含0.20.5mg/mlPEG20000的缓冲液中。,2020/11/4,19,4.胶体金标记蛋白的纯化,先低速离心，弃去聚集的胶体金颗粒，一般为5nm用9000r/min 离心20min；20nm用2000r/min 离心20min；,再高速离心：5nm胶体金结合物，60000g，4离心1h；20-40nm胶体金结合物，14000g，4离心1h；,仔细吸去上清，沉淀物用含1%BSA的0.01mol/L，pH7.6 PB混悬至原量；,平衡过夜后，同上重复离心2次，最后用1%BSA的0.01mol/L，pH7.6 PB(0.02%NaN3) 混悬至原量的1/10，分装， 4保存。,结合物内加50%的甘油可贮存于-18一年以上。,2020/11/4,20,三、免疫金的保存,免疫金复合物最终用,稀释液,配制成工作浓度保存。,稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。,稳定剂：蛋白质（小牛血清、BSA等）、葡聚糖、PEG2000、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明胶等。PEG和BSA最常用。,缓冲液：PB、PBS、Tirs等。,稳定剂的作用：,保护胶体金的稳定性，便于长期保存；,防止免疫金的非特异性吸附反应。,2020/11/4,21,第二节 金免疫测定技术,一、斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）,（一）原理,将抗原或抗体点加在固相载体NC膜上，制成的包被微孔滤膜贴置于吸水材料上，依次滴加在膜上的标本、免疫金、及洗涤液等液体很快渗入吸水材料中，最后阳性反应在膜上呈现红色斑点 。,特点,：快速、简便、经济、无需特殊设备、已成为床边检测的主要方法之一。,2020/11/4,22,床旁检验,POCT（Piont-Of-care Testing），国外对POCT的定义有“就在病人医疗现场对任何医疗措施所需进行的检验。不在中央检验室而在病人身边进行的检验，其结果可改进病人的保健措施”、“由临床实验室制订的，但不在检验科设施中对病人进行的测定，不需要固定、专用的场所。将试剂盒和一起手携或运送到病人身边就地进行即刻检验。”,2020/11/4,23,（二）技术类型,双抗体夹心法,Ab Ag（标本）金标抗体，滴加洗液洗涤，膜中央形成,红色斑点,间接法,AgAb（标本），滴加洗液洗涤金标,抗抗体,，滴加洗液洗涤，膜中央形成,红色斑点,2020/11/4,24,DIGFA原理图,操作示意图,装置分解图,盖,微孔膜,吸水垫料,底,2020/11/4,25,斑点金免疫渗滤试验,2020/11/4,26,（三）技术要点,1.试剂盒组成,滴金反应板、塑料小盒、吸水垫料、包被了抗原或抗体的硝酸纤维素膜、胶体金标记物、洗涤液,2.操作要点,孔内滴加标本，待完全渗入。,孔内滴加胶体金标记抗体，待完全渗入。,孔内滴加洗涤液，待完全渗入。,膜中央呈现红色或粉红色斑点为阳性。,斑点深浅相应提示阳性强度。,2020/11/4,27,二、斑点金免疫层析试验（DICA）,（一）原理,是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合，以微孔滤膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。滴加在膜一端的标本液受载体膜的,毛细管作用,向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果。,（二）技术类型,双抗体夹心法,竞争法,间接法,2020/11/4,28,毛细管作用,毛细管插入浸润液体中，管内液面上升，高于管外，毛细管插入不浸润液体中，管内液体下降，低于管外的现象。毛巾吸水，地下水沿土壤上升都是毛细现象。,在洁净的玻璃板上放一滴水银，它能够滚来滚去而不附着在玻璃板上。把一块洁净的玻璃板浸入水银里再取出来，玻璃上也不附着水银。这种液体不附着在固体表面上的现象叫做不浸润。对玻璃来说，水银是不浸润液体。,在洁净的玻璃上放一滴水，它会附着在玻璃板上形成薄层。把一块洁净的玻璃片浸入水中再取出来，玻璃的表面会沾上一层水。这种液体附着在固体表面上的现象叫做浸润，对玻璃来说，水是浸润液体。,浸润液体在细管里升高的现象和不浸润液体在细管里降低的现象，叫做毛细现象；能够产生明显毛细现象的管叫做毛细管。,2020/11/4,29,1、双抗体夹心法,A,G,T,C,B,A：滴加样品,B：手持端，吸水纸,G：金标抗体（免疫金）,T：包被抗体,C：包被抗金标抗体,2020/11/4,30,2、竞争法,A,G,T,C,B,A：滴加样品,B：手持端，吸水纸,G：金标抗体（免疫金）,T：包被标准抗原,C：包被抗抗体,2020/11/4,31,3、间接法,窗,吸水材料,金标抗人IgG,吸水材料,吸水材料,标本加样区,包被抗原,为了消除待测标本中非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标抗人IgG，故测抗体常用“反流免疫层析法”,标记线,合上检测盒,液体流动方向,2020/11/4,32,三、临床应用及评价,1. 操作简便、快捷、操作人员无需技术培训、不需特殊设备、试剂稳定、便于保存，特别符合“床边检验”。,2.灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法,3.不能准确定量，只能定性或半定量。,4.目前主要用于正常体液中不存在的物质（传染病抗原或抗体、毒品等）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质的检测。如：HCG,2020/11/4,33,练习题,1.金免疫技术有哪几个类型？常用哪一型？,2.简述斑点金免疫滲滤试验的原理及技术类型,3.简述斑点金免疫层析试验的原理,4.以图示斑点金免疫层析试验双抗体夹心法、竞争法的技术类型。,5.简述斑点金免疫层析试验的临床应用及评价,2020/11/4,34,